Lade Inhalt...

Versuchsprotokoll: DNA-Sequenzierung nach der Kettenabbruchmethode

Praktikumsbericht / -arbeit 2010 6 Seiten

Biologie - Humanbiologie

Leseprobe

Einleitung

Ein Meilenstein in der genetischen Forschung wurde mit der Ermöglichung einer genauen Analyse der Nukleotidsequenz von Nukleinsäuren (Sequenzierung) gesetzt. Durch die Kenntnis der gesamten bzw. einer bestimmten Erbinformation können komplette Genome von verschiedenen Organismen entschlüsselt (Human-Genom-Projekt!) und genetische Erkrankungen sowie molekularbiologische Klonierungsexperimente untersucht werden. Weiterhin kann durch die Kenntnis eines kodierenden DNA-Abschnitts auf die Aminosäuresequenz des translatierten Peptids/Proteins geschlossen werden.

Eine der klassischen Sequenzierungsmethoden stellt dabei die Didesoxymethode nach Sanger dar. Die Theorie basiert auf Derivaten der vier Nukleotide, deren Desoxyribosen am 3’-Ende die für die Ausbildung der verknüpfenden 3’-5’-Phosphodiesterbrücken essentielle Hydroxy-Gruppe fehlt. Bei der Replikation eines DNA-Stranges würde bei der Elongation mit einem dieser Didesoxyribonukleosidtriphosphate die Kette also unweigerlich abbrechen. Da der Polymerase bei der in vitro DNA-Synthese zusätzlich zu diesen Derivaten jedoch stets auch die herkömmlichen Nukleotide zur Sequenzverlängerung zur Verfügung stehen, erfolgt der Kettenabbruch immer an einer anderen Stelle, nämlich genau dann, wenn das Enzym zufällig eines der ddNTPs einbaut. Um die vier verschiedenen Nukleotide unterscheiden zu können, müssen vier Ansätze vorbereitet werden, die jeweils die zu analysierende, bereits denaturierte ssDNA, einen definierten Primer zur Replikationsinitiation, die DNA Polymerase, alle vier dNTPs sowie jeweils eines der ddNTP-Analogons enthalten. Durch die zufällige Verknüpfung eines ddNTP werden Ketten unterschiedlicher Länge synthetisiert, deren Abbruchnukleotid je nach Ansatz ein A, T, G oder C bildet, je nach Komplementär- struktur der Matrize und nach Art des ddNTPs. Mittels einer Elektrophorese können die Fragmente anschließend nach ihrer Größe aufgetrennt werden und, indem die Ansätze in vier parallelen Spuren laufen, das Abbruchnukleotid identifiziert werden. Als Gel dient dabei das Polyacrylamid, das eine hohe Auflösung der Molekulargrößen, deren Differenz schließlich nur ein einzelnes Nukleotid beträgt, ermöglicht. Zur Detektion der Fragmente müssen diese vor dem Start der eigentlichen Synthese mit einer kleinen Menge an radioaktiven Nukleotiden behandelt werden, um einen Markierungsbereich konstanter Größe direkt im Anschluss an den Primer zu erhalten.

Das Ziel des durchgeführten Versuchs war, entsprechend der o.g. Theorie, die Synthese von mehreren zu der zu analysierenden DNA-Sequenz aus dem pSPT18-Sp3-Gen (kodiert für einen Transkriptionsfaktor) komplementären Strängen unterschiedlicher Größe und deren anschließender elektrophoretischer Auftragung zur Identifikation der genauen Nukleotidkette.

Versuchsdurchführung

Der erste Schritt der Sequenzierung stellt die Denaturierung der noch doppelsträngigen, supercoiled Spender-DNA dar. Dazu wurde Natriumhydroxid verwandt, das durch seine basische Wirkung die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basenpaaren löst und somit die DNA in Einzelstränge zerfallen lässt. Zur Sicherstellung der Lösung aller Bindungen wurde eine Inkubationszeit von 10 min gewählt. Anschließend wurde die DNA präzipitiert und anschließend gewaschen, um sie zu isolieren.

Die Ausfällung wurde durch die Zugabe von 0,9 M NaAc und kaltem, reinem Ethanol erreicht. Die Kationen des NaAc-Salzes binden die negativen Phosphat-Gruppen der DNA, sodass diese mit dem Salz verklumpt und präzipitiert, da das Ethanol durch seine Hydrophobizität die Löslichkeit des Komplexes vermindert. Um diese Reaktion zu beschleunigen, wurde die Lösung 15 min auf Trockeneis gestellt und danach der Ethanol-Überstand im Anschluss an einem Zentrifugationsschritt entnommen. Zur Isolation der reinen DNA wurden die verbliebenen Salze in einem Waschschritt mit 75 %-igem Ethanol und einer weiteren Zentrifugation entfernt und die DNA im Speed-Vac getrocknet, bevor sie in Wasser gelöst wurde.

Nun konnte durch Hinzupipettieren der Primer-Lösung (es wurde der Sp6-Primer verwandt) und des „Annealing-Puffers“ die Primer-Hybridisierung eingeleitet werden. Der Puffer enthält unter anderem Magnesiumchlorid, da die DNA-Polymerase Mg2 + als Ko-Faktor für die späteren Syntheseschritte benötigt, und Dithiothreitol (DTT), das durch seine Thiogruppen ein reduktives Milieu schafft und die Polymere somit vor Oxidation schützt. Die Inkubationsphase für die Hybridisierung betrug 20 min bei 37°C und weitere 10 min bei Raumtemperatur.

Danach wurde die Terminationsreaktion dadurch vorbereitet, dass die vorbereiteten Nukleotidmischungen, die jeweils eine der vier NTPs in der didesoxy-Form enthielten, in vier Löcher einer Terazaki-Platte pipettiert wurden. Vor dem Start der Termination wurde die Markierungsreaktion gestartet, indem zu der nun mit Primern hybridisierten DNA ein ’Labelling’-Mix aus Natriumchlorid und minimalen Mengen (je 1,375 µM) dCTP, dGTP und dTTP, die T7 DNA-Polymerase und das mit Schwefel radioaktiv markierte dATPαS hinzugegeben wurde. Dadurch konnte an allen Primern ein unsignifikant kleines Stück DNA synthetisiert werden, das die zur späteren Detektion wichtigen radioaktiven Markernukleotide enthielt. Schließlich wurde mittels der Zugabe der Markierungsreaktion in die Terazaki-Platte die Synthese der zu sequenzierenden Kette gestartet, die durch die ddNTPs an verschiedenen Stellen terminiert werden sollte.

Nach einer kurzen Inkubationszeit von 5 min bei 37°C wurde die Stopp-Lösung hinzugegeben, die aufgrund des enthaltenen Ethylendiamintetraacetats (EDTA), das als Chelator zweiwertige Kationen bindet, der Polymerase ihren Ko-Faktor Mg2 + entzieht und diese somit inaktiviert. Darüber hinaus besitzt die Stopp-Lösung als weitere Komponenten deionisiertes Formamid, das zur Denaturierung der synthetisierten dsDNA führte und außerdem die DNA zur besseren Einsenkung in die Taschen während der folgenden Gelelektrophorese beschwerte, und zwei Farbstoffe. Die Farbstoffe wandern parallel zu sehr kleinen (Bromphenolblau) bzw. sehr großen (Xylencyanol) Nukleinsäuren und lassen durch ihre Farbe abschätzen, wie weit das Gel bzw. die entsprechend großen Fragmente maximal bzw. minimal gelaufen sein müssen.

In der Folge wurde das Polyacrylamidgel hergestellt und gegossen, um die Gelelektrophorese vorzubereiten. Das Gel besteht aus einer Acrylamidlösung, Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat (APS), wobei die beiden letzteren durch ihre Polymerisierungsreaktion die Verfestigung bewirkt und die Acrylamidlösung dem entstehenden Gel seine speziellen Eigenschaften gibt.

[...]

Details

Seiten
6
Jahr
2010
ISBN (eBook)
9783656057154
Dateigröße
2.1 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v182191
Institution / Hochschule
Philipps-Universität Marburg
Note
1
Schlagworte
kettenabbruch sanger didesoxynukleotid sequenzierung dna genetik

Autor

Zurück

Titel: Versuchsprotokoll: DNA-Sequenzierung nach der Kettenabbruchmethode