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Leseprobe

Inhalt

Einleitung

Berechnungen von Verdünnungen

Einheit von Stoffmenge

Puffer und Lösungen
DAB Lösung
Laemmli- Puffer
ECL- Detectionsreagenz

Molekularbiologische Untersuchungen
TE-Puffer
Coomassie- Färbung

Stammlösungen

Gelektrophorese

Kulturmedien
MacConkey-Agar
Tryptische Sojabouillon

Immunhistochemie (Puffer und Lösungen)
PFA (Paraformaldehyd)

Methoden

Arbeiten im Tiermodel
Narkose für das Arbeiten im Tiermodel
Arbeiten im Tiermodel
Präparation des Mäuseschädels
Präparation der cochlear
Paraffinschnitte der Cochlear
Vorbereitung von verknöcherten Präparaten
Die Einbettung in Paraffin

Gefrierschnitten
Färbung von Schnitten
HE -Färbung
Van Gieson- Färbung
Versilberung von Präparaten

Immunhistochemie (IHC)

Zellkultur
NTera 2-Zellen
Einfrieren von Zellen
Neuronale Differenzierung
Spaeroide
Protein Isolierung für Western-Blot
Proteinaufarbeitung aus der Zellkultur
Proteinaufarbeitung aus Gewebestücken

SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Trenngelpuffer
Sammelgelpuffer
Ammoniumpersulfat (ATS)
Trenngel (10%)
Sammelgel (5%):
5x Laufpuffer

Coomassie Blau- Färbung
Coomassi-Lösung
Coomassie Entfärber

Western-Blot:
Immunodetektion
Strippen der Membran für Western Blots
Stripping Puffer

DAB-Färbung
PFA
DAB-Stammlösung

Bestimmung von RNA-Konzentrationen
Proteinbestimmung nach Bradford
Proteintest

DNA (Desoxyribonukleinsäure)

PCR-Protokolle
Berechnung der Annealing Temperatur
PCR Techniken
RT-PCR (real-time PCR
Nested-PCR
Schema der PCR

Puffer- Sammlung
Ammoniumacetat 10M
Ampicillin
0.5 M EDTA (pH8,0)
SOC-Medium
20xSSC
DNase-Puffer
DTT

Anhang
Die wichtigsten Aminosäuren
Antikörper:
Angaben von Konzentrationen

Literaturverzeichniss:

Einleitung

Dieses Laborhandbuch habe ich, durch langes Sammeln an Erfahrungen erstellt. Mein Anliegen ist vor allem das arbeiten in einem Labor zu erleichtern. Hierbei werde ich die Grundlagen der Laborbiologie erklären, die nicht nur Biologie, Laboranten, medizinische Assistentinnen, sondern auch für Studenten nützlich sein könnte.

Ich habe im Laufe meiner langjährigen Berufstätigkeit viele hilfreiche Methoden zusammenstellen können. Gut ausgearbeitete Methoden sind die Grundlagen für gute Labor Ergebnisse.

Um eine Labormethode in einem Labor zu etablieren, benötigt man nicht nur sehr viel Zeit, sondern auch sehr viel Geduld. Nicht alle Laborversuche funktionieren im ersten Durchgang. Daher fordert die Tätigkeit in einem wissenschaftlichen Labor, steht’s eine gewisse Frustrationstoleranz. Der Erfolg jeder Arbeit wird nicht zuletzt von Erfahrungen, grundlegendes Wissen und Disziplin bestimmt, sondern auch vom Durchhaltevermögen. Jeder der in einem Labor gearbeitet hat, kennt das Phänomen, das Versuche die immer funktioniert haben, plötzlich aus heiterem Himmel nicht Funktionieren. Nach Überprüfung der möglichen Fehlerquellen, wie Puffer, Lösungen, Chemikalien und Apparaturen, bleibt am ende nur noch die Wiederholung des Versuches in der Hoffnung, das es diesmal funktioniert. Warum trotz der guten Vorbereitung manche Versuche dennoch nicht funktionieren, steht manchmal in den Sternen und mag mit unwissenschaftlichen Phänomenen zusammenhängen, die wir nicht erklären können. Daher mag ich behaupten das, dass Durchhaltevermögen und die Disziplin in einem Labor am wichtigsten sind.

Durch diese Sammlung an Methoden möchte ich zumindest eine kleine Grundlage schaffen. Gerne können diese Methoden verbessert und von jedem optimiert werden.

Berechnungen Verdünnungen

Grundlegende Berechnungen von Lösungen, wie z.B. Verdünnungen, Volumina und Konzentrationen sind für die allgemeine Arbeit in einem Labor ganz besonders wichtig.

Als Erstes müssen wir wissen, was eigentlich eine Lösung ist. Dabei sollten wir uns merken, dass eine Lösung immer eine homogene Mischung aus zwei oder mehreren Substanzen ist.

Lösung = Lösungsmittel + gelöste Substanzen

Im Laufe einer Laborarbeit werden wir früher oder später vor die Aufgabe gestellt, eine Verdünnung herzustellen. Erstaunlicherweise stellt dies für manche ein Problem dar. Auch hier sollten wir uns erst einmal klar darüber werden, was es eigentlich bedeutet, wenn man von der Verdünnung einer Lösung spricht.

Eine Verdünnung bedeutet immer das Herabsetzen der Konzentration eines gelösten Stoffes in der Lösung. Entscheidend für die Berechnung einer Verdünnung ist immer zu wissen, dass sich die Menge der gelösten Substanzen nicht verändert. Dieses läst sich am besten an ein einfaches Beispiel erklären.

Wenn ich zum Beispiel einer Zuckerlösung Wasser hinzufüge, so ändert sich an der Menge bzw. Der Anzahl an Zuckermoleküle nichts. Dies bedeutet nichts anderes, als das die Menge der gelösten Substanzen vor der Verdünnung gleich der Menge der gelösten Substanzen nach der Verdünnung ist. Anhand einer einfachen Gleichung kann man sich die Verdünnung bildlich machen. Wichtig ist immer zu berücksichtigen, dass sich die Menge einer Lösung immer aus der Konzentration mal das Volumen in der Lösung ergibt.

Volumen 1 x Konzentration1 = Volumen 2 x Konzentration 2

Am der folgenden praktischen Fragestellung, die uns vielleicht sogar täglich in einem Labor begegnet, werde ich eine Verdünnung der Lösung genauer verdeutlichen.

Aus einer 10%igen NaCl Lösung sollen 50 ml einer physiologische NaCl Lösung hergestellt werden.

Eine 10%igen NaCl-Lösung enthält 10g NaCl auf 100ml H2O. Eine physiologische Kochsalzlösung ist 0,9%ig, also enthält sie 0,9g/100ml. Dies bedeutet:

V1 =? K1=10g/L

V2 = 50ml K2=0,9g/Ll

V1 x K1 = V2 x K2

V1 x 10 = 50 x 0,9

V1 = 50x0,9 / 10= 4,5 ml

Somit werden 4,5ml der 10%igen NaCl Lösung mit Wasser auf 50ml aufgefüllt.

Wie so oft führen viele Wege nach Rom und somit gibt es auch mehrere Möglichkeiten Verdünnungen zu berechnen. In den folgenden Beispielen werde ich einige Berechnungen für Verdünnungen vorstellen.

Beispiel:

Wie müssen 100ml einer 5mol/L NaCl-Lösung verdünnen werden, um eine 2mol/L NaCl Lösung mit zu erhalten?

Die erste Möglichkeit zu einem Ergebnis zu gelangen, ist wie hier bereits beschrieben.

c1 x V1 = c2 xV2

5 mol/L x 0,1 L = 2mol/L x V2L

V2 = 0,25 L

V2 = 250ml

Dies bedeutet, es werden 100ml der Ausgangslösung bis auf 250ml mit Wasser aufgefüllt oder um es genauer auszudrücken, es werden 100ml der NaCl mit 150ml Wasser gemischt.

Ein weiterer Lösungsansatz wäre folgende Berechnung:

c1 x V1 = c2 x V2

V1/V2 = c2/c1 = 2/5

In diesem Fall verhält sich das Volumen proportional verkehrt zur Konzentration. Wenn ich die Konzentration von 5 auf 2 mol/L verdünnen möchte, muss ich die Lösung 2 zu 5 verdünnen.

2ml x 5ml

100ml x ? ml

? = 5/2 x 100ml

= 250ml

Dieser einfache Dreisatz lässt uns zum selben Verdünnungsergebnis kommen.

Die Bedeutung von Mol

In einem Labor wird oft Verbindung mit Lösungen und Suspensionen, oft die Bezeichnung Mol verwendet. Nach meinen Erfahrungen führt dieses manchmal bei Laboranten zur Verwirrung.

Was wird eigentlich unter Mol verstanden?

Die Molare Masse M ergibt sich aus der Masse m und der Stoffmenge n. Dies ergibt somit, folgende Formel.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

M = m / n mit der Einheit Kg/mol bzw. g/mol

Wir müssen und verdeutlichen, dass 4M das gleiche ist, wie 4mol/L. Dies bedeutet, das die Molare Masse der eigentlichen Konzentration der Lösung entspricht. Die Konzentration lässt sich aus c = n /V berechnen.

Eine weitere gängige Angabe in Laboratorien, die ebenfalls oft zur Verwirrung führt, ist zum Beispiel die Angabe von 1N HCL. Hierbei wird mit N die Normalität einer Lösung bezeichnet. Diese Bezeichnung sagt uns, dass es sich in diesem Fall um eine einprotonige Säure handelt. Dabei ist 1N nichts anderes als 1M.

An einem einfachen Beispiel möchte ich kurz verdeutlichen, was genau unter Mol verstanden wird.

Zum Beispiel werden im Labor 0,25mol Schwefelsäure benötig, wie viel Gramm muss für die Herstellung der Lösung abgewogen werden?

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

n = m /M

(n) bezeichnet die Stoffmenge eines bestimmten Stoffes in mol, (m) steht für die Masse eines Stoffes in Gramm, (M) hingegen ist die Molare Masse eines Stoffes in g/mol).

M (H2SO4) = 98,08 g/mol

m (H2SO4) = n (H2SO4) x M (H2SO4)

m = 0.25 mol x 98,08g/mol

m = 24,52g

Umrechnung der Massenkonzentration

Ein kleines Hinderniss, stellt immer die Umrechnung der Massenkonzentration dar.

Ein einfaches Beispiel um die Umrechnung von der Massenkonzentration in Stoffmengenkonzentration darzustellen, wäre zum Beispiel die Umrechnung von Glucose, dass in jedem Lehrbuch zu finden ist.

Wie viel mmol/L sind zum Beispiel in 110 mg/dL?

Die Antwort auf diese Frage ist nicht besonders schwer, auch wenn uns allein eine Blockade, bei der Maßeinheit mg/dL entsteht. Als erstes müssen wir wissen, welches Molekulargewicht Glucose (C6H12O6) besitzt. Diese Angaben finden wir entweder in der Literatur oder noch einfacher als Angabe auf dem glucose Behälter.

Glucose besitzt das Molekulargewicht von 180 Dalton. Als erstes berechnen wir mg/dL in Liter um, d.h. 110mg/dL entsprechen 1100mg/L. Als Nächstes müssen wir mg in mmol umrechnen, diese geschieht mit folgender Formel:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

c = m/M

Es gilt:

Masse (m) = Stoffmengenkonzentration (c) / Massenkonzentration (M)

Bzw.: c = m / M

= 1100 /180

= 6,1mmol/L Glucose

Also entsprechen 110mg/dL genau 6,1mmol/L glucose
Als Übersicht und zur Erinnerung habe ich hier folgende Maßeinheiten zusammengestellt, die evtl. und in vieler Hinsicht hilfreich sein können.

Die Einheit der Stoffmenge ist mol:

Einheit der Stoffkonzentration ist mol *1-1 abgekürzt M (Molar), d.h. somit:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

1M (molar): die Lösung enthält pro Liter 1mol des Stoffes

1mM (milimolar): die Lösung enthält pro Liter 10-3mol des Stoffes

1µM (mikromolar): die Lösung enthält pro Liter 10-6mol des Stoffes

1nM (nanomolar): die Lösung enthält pro Liter 10.10mol des Stoffes

Die Angaben von Konzentrationen werden einfachheitshalber in Potenzen angegeben. Zum Beispiel:

1 = 100 =10x10-1

0,1 = 10-1= 10x10-2

0,01 = 10-2 = 10x10-3

0,001 = 10-3 = 10x10-4

Eine normale Schreibweise zum Beispiel für 0,000856 wäre 8.57* 10-4.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Puffer und Lösungen (Rezepte):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

ECL- Detectionsreagenz für Blot (hausgemacht):

Lösung A (SA = im Kühlschrank lagern): 200ml 0,1M Tris-HCL (pH 8,6) 50mg Luminol (Sigma A4685)

Lösung B (SB = bei RT dunkel lagern): 11mg para- Hydroxycoumarinsäure (Sigma C9008) in 10ml DMSO lösen.

H2O2 (35%)

Durchführung:

1ml SA + 0,3µl H2O2 (30%) + 100µl SB mischen. Die Blot-Membran für 2min. inkubieren. Es sollte dabei beachtet werden, dass die Lösung gut auf die Membran verteilt wird. Für die Filmexposition von einer 13x7cm großen Membran genügen ca. 4ml der Lösung (4ml SA+1,2µl H2O2 (30%) + 400µl SB).

Molekularbiologische Untersuchungen:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Agarose für die Gelektrophorese:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Ethidiumbromidloesung (Fa. Merck, Darmstadt, Deutschland): 1µl / 10ml Puffer

100bp DNA Ladder (Fa. MBI Fermentas)

Aufbewahrt werden sollte 10mM Tris-HCL (pH 7,6) + 1mM EDTA gelöst in Auftragspuffer.

Auftragspuffer (Fa. MBI Fermentas, Litauen)

50% Glycerin

100mM EDTA (pH 8,0)

0,25% Bromphenolblau

0,25% Xylencyanol

1KB Ladder (Fa. Gibco)

20µl DNS, KB-Ladder 250µ / 244 mUE

20µl H2O

10µl Stoppmix

450µl 25x TBE-Puffer

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Kulturmedien:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Blutagar ist ein Differenzierungsagar, dass zur Überprüfung von hämolysefähigen Bakterien dient.

MacConkey-Agar (dient der Selektion von E.coli für die Kolonien-blots):

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Tryptische Sojabouillon (Selektivanreicherung zum Nachweis von STEC):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Immunhistochemie (alle Puffer und Lösungen):

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Die Lösung wird anschließend für ca. 10min. mit der Hilfe eines Ruhrschweins gerührt. Für die Aufbewahrung wird die Suspension in 1,5ml E-Cup verteilt und bei -20ºC weg gefroren.

Für 10ml Ziegenserum wird 1,8ml d.h. 1800µl Triton X-100 verwendet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

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Details

Seiten
56
Jahr
2012
ISBN (eBook)
9783656141327
ISBN (Buch)
9783656141532
Dateigröße
2 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v189827
Note
Schlagworte
Labormethoden Labor Methoden Methoden Laborarbeit Experimente Laborexperimente Biologie Molekular Biologie Labormethoden für MTA; Laboranten Biologiestudenten Laborpraxis Labor leicht gemacht

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Titel: Allgemeine Labormethoden