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Wachstumsstudien mit membranaktiven Antibiotika in B. subtilis und Erstellung von Konditional-Mutanten mit essentiellen Genen der Zellteilung

Forschungsarbeit 2008 17 Seiten

Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie

Leseprobe

Inhaltverzeichnis

1. Einleitung

2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Medien und Antibiotika
2.1.2 Puffer und Lösungen
2.1.2.1 Puffer und Lösungen zur Herstellung kompetenter E. coli -Zellen
2.1.2.2 Puffer und Lösungen zur Probenaufbereitung
2.2 Methoden
2.2.1 Herstellung kompetenter E. coli- Zellen
2.2.2 Transformation
2.2.3 Bakterienanzucht
2.2.4 Bestimmung des Bakterienwachstums
2.2.5 Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)
2.2.6 Durchführung von Wachstumstests

3. Ergebnisse
3.1 Bestimmung der MHK verschiedener Antibiotika
3.2 Wachstumstest
3.2.1 Wachstumstest mit Ionomycin:
3.2.2 Wachstumstest mit Calcimycin:
3.2.3 Wachstumstest mit Nigericin:
3.3 Erstellung einer B. subtilis -Konditionalmutante
3.3.1 Isolation chromosomaler DNA von B. subtilis und B. megaterium
3.3.2 Vermehrung und Isolation des Klonierungsvektors pDG1731

4. Diskussion
4.1 Bestimmung der MHK und Wachstumstests
4.2 Erstellung einer B. subtilis -Konditionalmutante

1. Einleitung

Durch die Entstehung immer neuer Resistenzen und Bildung multiresistenter Stämme von Bakterien gegen herkömmliche Antibiotika, hat die Bedeutung der Erforschung und Evaluierung von Antibiotikawirkorten und –Mechanismen zur Entwicklung neuer Antibiotika zugenommen. Dazu können antibakteriell wirkende Stoffe auf ihre molekularen Funktionen hin untersucht werden, um z.B. Verbesserungen zu erreichen, aber auch potentielle Wirkorte für die Entwicklung neuer Antibiotika lokalisiert werden. Um diese molekularen Interaktionen untersuchen zu können, bedient man sich der modernen Proteomanlayse. Hierbei spielt die zweidimensionale, elektrophoretische Auftrennung von Proteinen (2D-Gelelektrophorese) eine große Rolle. Bei dieser Methode, bei der die zweidimensionalen Auftrennungsschritte orthogonal zueinander durchgeführt werden, wird in der ersten Dimension eine Auftrennung von Proteinen nach ihrem isoelektrischen Punkt erreicht (Isoelektrische Fokussierung). Diese Auftrennung findet auf einem Gel mit einem pH-Gradienten statt, so dass sich die aufgetragenen Proteine entsprechend ihrer Gesamtladung auf dem Gel orientieren können. In der zweiten Dimension werden die Proteine durch eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) erneut aufgetrennt. Dieser Schritt führt dann dazu, dass die bereits nach Gesamtladung aufgetrennten Proteine ebenfalls nach ihrer Größe aufgetrennt werden. Die so entstandenen Gele (Abb. 1) können dann mehreren Schritten der Auswertung unterzogen werden. Dazu gehören z.B. Färbungen (Absorptions- und Fluoreszenzfärbungen), aber auch die radioaktive Markierung der Proteine (Pulse Labeling). So können im Anschluss Proteinmengen, Anzahl der verschiedenartigen Proteine (Spezies) und neusynthetisierte Proteine bestimmt und verglichen werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 1: Mit Coomassie gefärbtes 2D-Gel auf dem cytosolisches Gesamtprotein aus B. subtilis aufgetrennt wurde. Die Kultur wurde dabei unter Standardbedingungen angezogen. Es lassen sich mehrere Proteinanhäufungen (Spots) erkennen. Die Größe bzw. Intensität der Spots können dabei z.B. Hinweise auf die Konzentration geben.

Im Praktikum wurden vor allem Versuche durchgeführt, die vorbereitend für anschließende 2D-Gelektrophoretische-Auswertungen sind. Es handelt sich dabei um die Durchführung von Wachstumstests mit B. subtilis, bei denen mit Hilfe von Antibiotika eine Stressantwort auf Proteinebene induziert werden soll. Bei den Wachstumstests soll eine Konzentration des eingesetzten Antibiotikums erreicht werden, die für vergleichende Proteomanalysen mit 2D-Gelektrophorese optimal ist. Die dafür eingesetzten Antibiotika gehören zur Klasse der Ionophore, welche Moleküle sind, die Membranen durchlässiger für Ionen machen bzw. Ionen durch Membranen transportieren können. Man kann Ionophore in zwei Kategorien unterteilen: Zum einen gibt es die kanalbildenden Ionophore, zum anderen die Carrier-Ionophore. Bei den kanalbildenden Ionophoren handelt es sich um Peptide, die sich in die Membran integrieren und somit Kanäle bilden, die durchlässig für Ionen sind. Carrier-Ionophoren hingegen sind Moleküle, die Ionen auf auf einer Seite der Membran binden können, anschließend durch die Membran migrieren und dort die zuvor gebundenen Ionen wieder freigeben. In diesem Praktikum wurden Carrier-Ionophoren verwendet: Ionomycin, ein Ionophor, der in Streptomyces conglobatus vorkommt und vor allem Ca2+ durch Membranen transportiert. Calcimycin, das mehrere zweiwertige Kationen (Mn2+ > Ca2+ > Mg2+ >> Sr2+ > Ba2+) durch Zellmembranen transportieren kann und z.B. dafür sorgt, dass die Atmungskette entkoppelt wird. Und Nigericin, das H+, K+ und Pb2+ durch Zellmembranen befördern kann, aber meistens als H+-K+-Antiporter vorliegt. Ionophore werden, nicht nur als Antibiotikum, in vielen Bereichen der Forschung eingesetzt, sondern kommen auch in der industriellen Viehzucht zum Einsatz. Des Weiteren sollte während des Praktikums eine Konditional-Mutante für essentielle Zellteilungsgene von B. Subtilis erstellt werden, um mit anschließender Proteomanalyse mögliche Wirkorte für Antibiotika zu evaluieren.

2. Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Medien und Antibiotika

Alle aufgeführten Medien wurden autoklaviert bzw. bei hitzelabilen Bestandteilen steril filtriert.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Minimalmedium für B. subtilis:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Auf 100 ml wurden folgende Supplemente hinzugegeben:

ÜN-Medium:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Medien zur Transformation von E. coli (XLI Blue-Stamm):

SOB-Medium:

Die folgenden Angaben verstehen sich unter der Zugabe von 1 Liter Reinstwasser 20 g Trypton

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

SOC-Medium:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Verwendete Antibiotika:

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.2 Puffer und Lösungen

2.1.2.1 Puffer und Lösungen zur Herstellung kompetenter E. coli -Zellen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.1.2.2 Puffer und Lösungen zur Probenaufbereitung

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

2.2 Methoden

2.2.1 Herstellung kompetenter E. coli- Zellen

100 ml LB-Medium wurden mit 2 ml einer E. coli -ÜN-Kultur angeimpft und bei 37°C auf eine OD580 von 0,5 angezogen. Je 50 ml der Kultur wurden anschließend für 10 Minuten bei 4000 rpm zentrifugiert. Das isolierte Pellet wurde hinterher in 25 ml kaltem TMF-Puffer resuspendiert und dann für 1 Stunde auf Eis inkubiert. Nach der Inkubation auf Eis wurde erneut zentrifugiert. Diesmal für 10 Minuten bei 3000 rpm. Das entstandene Pellet wurde dann mit 5 ml des kalten TMF-Puffers resuspendiert und 1,5 ml Glycerol als Frostschutz hinzugegeben. Im Anschluss wurde die Probe aliquotiert zu ca. 25 á 260 µl und bei -80°C gelagert.

2.2.2 Transformation

Zunächst wurden der Anzahl der Proben entsprechend Falcon Tubes auf Eis vorgekühlt. Gleichzeitig wurden 900 µl/ pro Probe SOC-Medium im Heizblock auf 42°C vorgeheizt. Die bei -80°C gelagerten kompetenten Zellen wurden anschließend auf Eis langsam aufgetaut und hinterher 50 µl der aufgetauten Kultur in ein gekühltes Falcon Tube gegeben. Zusätzlich wurde in das Falcon Tube 1 µl einer 0,1 ng/µl Plasmidlösung (höchste Effizienz) gegeben. Die so vorbereiteten Tubes wurden dann für 20 Minuten auf Eis gelagert. Im Anschluss wurden die Proben für genau 45 Sekunden im Wasserbad bei 42°C gelagert. Hiernach erfolgte eine Lagerung auf Eis für weiter 2 Minuten. Das vorgewärmte SOC-Medium wurde im nächsten Schritt hinzugegeben und die Proben für 30 Minuten bei 37°C leicht geschüttelt.

2.2.3 Bakterienanzucht

Die Anzucht von B. Subtilis und E. coli bei 37°C wurde auf LB-Agar oder in Flüssigmedium (Minimal- und LB-Medium) mit entsprechenden Antibiotika durchgeführt. Dabei wurden die Flüssigkulturen (5ml) in Reagenzgläsern auf einem Brutroller inkubiert. Die Übernachtkulturen (ÜN-Kulturen) wurden mindestens für 16h eingelagert.

2.2.4 Bestimmung des Bakterienwachstums

Die Bestimmung der Zellzahl erfolgte Photometrisch bei 500 nm, wobei die OD500 = 1 einer Zellzahl von 2 x 108 Zellen entspricht.

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Details

Seiten
17
Jahr
2008
ISBN (eBook)
9783656154839
ISBN (Buch)
9783656154860
Dateigröße
890 KB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v190622
Institution / Hochschule
Ruhr-Universität Bochum – Lehrstuhl für Mikrobiologie
Note
1,3
Schlagworte
Antibiotika Antibiotikum Bacillus Subtilis Konditionalmutanten Ionomycin Calcimycin Mikrobiologie Molekulare Genetik Genetik Resistente Bakterien Antibiotikaresistenz 2D-Gelelektrophorese Proteomics

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Titel: Wachstumsstudien mit membranaktiven Antibiotika in B. subtilis und Erstellung von Konditional-Mutanten mit essentiellen Genen der Zellteilung