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Evaluación de la biotransformación de selenio inorgánico en el proceso de fermentación láctica

Magisterarbeit 2008 66 Seiten

Chemie - Analytische Chemie

Leseprobe

ÌNDICE

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Objetivos

1. Introducción
1.1 Aspectos generales de selenio
1.2 Incorporacióndelselenioaproteinas
1.3 Importancia del selenio corno un suplemento nutricional
1.4 Toxicidaddelselenio
1.5 Antecedentes en la especiación y cuantificación de selenio

2. Parte experimental
2.1 Aparatos, material y reactivos
2.2 Procedimientos
2.2.1 Fermentación láctica del yogurt en presencia de selenio inorgànico
2.2.2 Tratamiento de diàlisis en yogurt
2.2.3 Determinación de selenio total
2.2.4 Hidrólisis enzimàtica
2.2.5 Hidrólisis àcida
2.2.6 Reducción y alquilación de selenocistina
2.2.7 Oxidación de selenometionina
2.3 Determinación de las especies orgànicas de selenio
2.3.1Cromatografia deintercambioaniónico
2.3.2 Cromatografia de fase inversa con formadores de pares iónicos (IPRP- HPLC-ICP-MS)

3. Resultadosydiscusión
3.1 Tolerancia al selenio inorgànico afiadido durante el proceso de fermentación làctica
3.2 Estudio de la recuperación de selenio en yogurt enriquecido: Validación del mètodo de determinación de selenio total
3.3 Estudio de la biotransformación de selenio durante el proceso de fermentación làctica para la obtención de yogurt
3.4 Evaluación del proceso de hidrólisis enzimàtica asistida por sonda ultrasonido (US). Reproducibilidad y comparación con la hidrólisis àcida
3.5 Separación cromatogràfica de especies de selenio: Optimización de las principales variables
3.6 Determinación de las especies de selenio en las muestras de yogurt enriquecido en selenio por HPLC-ICP-MS
3.7 Reducción y alquilación de la selenocistina

4. Conclusiones

5. Bibliografia

OBJETIVOS

El selenio es un elemento esencial en la dieta humana que a su vez puede resultar tóxico, existiendo un estrecho margen entre la cantidad que produce efectos beneficiosos o tóxicos. Además ambos efectos dependerán de la concentración y de la forma quimica. Las formas orgánicas son mucho más biodisponibles que las inorgánicas, en concreto los selenoaminoácidos se incorporan a las proteinas, principalmente como selenometionina (SeMet), selenocisteina (SeCys) y selenocistina (SeCys2). Otras especies, en principio no proteicas, como la seleno-metil-selenocisteina (SCM), son en la actualidad el objetivo de numerosas investigaciones que la relacionan con propiedades antioxidantes y anticancerigenas, entre otras funciones biológicas.

La utilización de suplementos alimenticios enriquecidos con selenio se está investigando y desarrollando en la actualidad, debido a sus propiedades antioxidantes y a su capacidad para prevenir ciertos tipos de cánceres, enfermedades cardiovasculares y otros tipos de enfermedades. Este tipo de alimentos son una excelente alternativa para personas con déficit de selenio, pudiéndose regular su concentración mediante el control de la ingesta diaria. Hasta el momento hay pocos suplementos alimenticios enriquecidos en selenio siendo las levaduras las más populares.

El objetivo principal de este trabajo es estudiar la posibilidad de obtener un yogurt enriquecido en selenio inorgánico que pueda ser fuente de selenoproteinas para personas con déficit de selenio. Las etapas a desarrollar para alcanzar el objetivo principal son las siguientes:

1. Estudiar la bioincorporación de selenio inorgánico durante el proceso de fermentación láctica en el yogurt.
2. Optimizar de la separación de especies de selenio mediante cromatografia liquida de alta eficacia (HPLC) utilizando fase inversa (RP) y pares de iones (IP).
3. Valorar la eficacia de la sonda de ultrasonidos en la hidrólisis enzimática de las proteinas en comparación con la hidrólisis ácida.
4. Identificar las especies orgànicas de selenio presentes en el yogurt enriquecido con selenio inorgànico, utilizando como tècnica de separación e identificación la cromatografia liquida de alta eficacia acoplada a un detector de plasma masas, HPLC- ICP-MS.

1. INTRODUCCIÓN

1.1. Aspectos generales del selenio

principal forma quimica en la que se encuentra el selenio en la naturaleza es el seleniuro combinado con elementos pesados. En menor proporción está como elemento libre asociado con azufre elemental e hidrógeno. Al reaccionar con el hidrógeno forma seleniuro de hidrógeno (H2Se) gas, que disuelto en agua puede precipitar iones de metales pesados. En la industria el selenio se ha utilizado como pigmento en plásticos, pinturas, barnices, cerámicas, tintas, aditivo metalúrgico, etc. En la naturaleza el selenio se encuentra bajo seis formas isotópicas estables. En la Figura 1 se muestra la abundancia relativa de las mismas, siendo el isótopo más abundante el 80Se, seguido del 78Se, 76Se y 82Se.

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El estudio de las especies de selenio ha sido de gran interès en la ùltima década ya que el efecto beneficioso o toxico del selenio depende de su forma quimica. Su identificación y cuantificación, se lleva a cabo, generalmente, mediante separación por cromatografia de liquidos de alta resolución (HPLC) empleando como detector la espectrometria de masas inorgànica con fuente de iones de plasma con acoplamiento inductivo (ICP-MS) [2].

Tabla 1. Principales especies de selenio. [2-4].

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1.2 Incorporación del selenio a proteinas

La incorporación de selenio inorgànico (Na2SeO4, NaSeO3) a organismos vivos esta relacionada con la presencia de especies orgànicas. Estos compuestos de selenio son reducido por la enzima glutationa (GSH), hasta llegar a H2Se el cual se combina con grupos fosfatos formando HSePO3- punto de partida para la sintesis de selenoproteinas.

Los estudios en mamiferos de muestran que hay por lo menos 30 selenoproteinas [5-6]. La incorporación del aminoàcido selenocistina (SeCys2) a proteinas es especifica a diferencia de la selenometionina (SeMet) que se incorpora por vias no reguladas homeostàticamente, debido a que la transcripción del àcido desoxirribonucleico no discrimina entre metionina y SeMet [7]. El selenio es excretado por la orina en forma metilada ((CH3)Se+) o acetilada (acetilgalactosaminado) (Figura 2) [8]. El procesos de biotransformación del selenio inorgànico a especies orgànicas se describen en varias publicaciones [2-9].

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Figura 2. Proceso de biotransformación de selenio inorgànico (Na2SeO4, NaSeO3, Se-2) en especies orgànicas

La selenocisteina (SeCys) tiene una estructura igual a la cisteina, diferenciàndose ùnicamente en que un àtomo de selenio remplaza al azufre. En la sintesis de la SeCys estàn implicados cuatro genes de transcripción del àcido desoxirribonucleico de la célula; selA, selB, selC, y selD. El gen tRNA (selC) codifica la serina; el gen tRNA (SelA) convierte serina a cisteina; el gen tRNA (selD) es el donador de selenio, y el factor de la traducción del gen tRNA (selB), reconoce el selenocisteil-tRNA, lo entrega al UGA en el ribosoma para la sintesis de las selenoproteinas.

Se puede hacer una subdivisión de las selenoproteinas en dos grupos, basados en la localización de la selenocisteina en los polipéptidos [7-12].

Grupo A: La SeCys esta localizada en la posición N-Terminal del dominio funcional.

Glutatión peroxidasa (GPx)

Selenoproteina P (Se-P)

Selenoproteina W (Se-W)

Grupo B: La SeCys esta localizada en la posición de C-Terminal del dominio funcional.

Tiorredoxina reductasa (TR)

Iodotironina iodinasa (ID)

El papel fisiológico principal de la selenoproteina glutatión peroxidasa (GPx) es mantener bajos los niveles de concentración de peróxido de hidrógeno dentro de la célula y asi disminuir el dano potencial a membranas y otras estructuras de la célula por radicales libres [13], es decir ejerce una acción antioxidante.

Se han descrito por lo menos seis GPx en mamifero [14]. La GPx1 es el principal antioxidante en el citosol de la célula. La GPx2 y GPx3 son antioxidantes encontrados en el aparato gastrointestinal y en el plasma. La GPx4 actúa reduciendo especificamente los hidroperóxidos de los ácidos grasos [15]. La GPx5 y GPx6 se detectan fácilmente dentro del epididimo del ratón y del epitelio olfativo, respectivamente [16].

La selenoproteina P (Se-P) es la principal especie orgánica de selenio en el plasma. Se expresa en varios tejidos finos: células endoteliales arteriales y células endoteliales hepáticas, y actúa como una proteina de transporte y antioxidante en el endotelio [17].

La Tiorredoxina reductasa (TR) es una proteina redox extensamente distribuida, que regula procesos redox-dependientes intracelulares. Entre las funciones descritas destacan las siguientes: donante del hidrógeno para la reductasa del ribonucleótido, regula las enzimas y los factores de la transcripción para control redox de grupos tioles, es una de las proteinas implicadas en los mecanismos de reparación de la sintesis del ADN [18] y estimula la proliferación de las células normales.

El selenio es esencial para la sintesis y metabolismo de las hormonas tiroideas. La mayoria de la triyodotironina (T3) biológicamente activa, es sintetizada por tiroxina (T4). Esta reacción es catalizada por enzimas dependientes de selenio "deiodinasa" [19­20].

Las especies orgánicas más conocidas son: selenometionina (SeMet), selenometil-selenocisteina (SMC) y selenocistina (SeCys2). Estas son absorbidas rapidamente y biotransforman a otras especies orgánicas. La SeMet es la especie mayoritaria en suplementos alimenticios (levaduras enriquecidas en selenio), es absorbida y almacenada dentro del cuerpo humano, se incorpora a proteinas tales como la albúmina y hemoglobina para sustituir a la metionina [21]. La SeCys2 se reduce a SeCys.

La SeCys libera el selenio dando paso a la formación del seleniuro de hidrógeno (H2Se) [8]. La SCM se hidroliza obteniendo la SeCys y el metil-selenio. El metil- selenio por desmetilación forma el seleniuro de hidrógeno (H2Se). El H2Se reacciona con radicales fosfatos para unirse a proteinas (Figura 2), por lo que, el H2Se es el principal precursor para la sintesis de proteina [8-9].

1.3 Importancia del selenio como suplemento nutricional

El selenio tiene un papel nutricional importante en los seres vivos [22]. En la década de los 50, Schawarz y Foltz [23] realizaron estudios en ratas y concluyeron que el selenio tenia una función antioxidante, reduciendo la necrosis hepática por déficit de vitamina E. La función reductora de la SeCys2, presente en la enzima glutation peroxidasa (GPx) en humanos, fue comprobada por Rotruck et al [13] en la década de
los 70. Desde entonces ha crecido considerablemente la investigación sobre alimentos enriquecidos con selenio [24].

Los habitantes de ciertos paises con regiones àridas como Australia, Corea del Norte, China central, Nepal, Tibet, Africa central y particularmente la Repùblica Democràtica de Congo [17], tienen dèficit de selenio en la dieta. Rayman [25] ha recomendado una ingesta diaria de selenio, teniendo en cuenta factores como el pais de origen, la edad y el sexo. Estos estudios, que han sido recientemente completados, indican que la ingesta necesaria cuando hay un dèficit de selenio en el humano es de 55­70 μg dia-1 [26-27].

El dèficit de selenio puede originar entre otras enfermedades, la de Keshan (enfermedad cardiaca) que afecta principalmente a nifios, mujeres embarazadas y en lactancia, con una mortalidad cercana al 50% si no se trata a tiempo. Esta enfermedad fue detectada por primera vez en la provincia de Keshan en China [21] y en la actualidad puede prevenirse administrando selenio en la dieta.

Otra enfermedad es la llamada de Kashin-Beckse que se caracteriza por la rigidez simètrica, tumefacción y dolor en las articulaciones interfalàngicas de los dedos de las manos, seguidas de osteoartritis generalizada, que afecta los codos, las rodillas y los tobillos [28].

Los estudios sobre la función del selenio en diferentes campos de la biologia y de la bioquimica han permitido conocer mejor sus mecanismos de acción. Por ejemplo, en los eritrocitos el selenio actùa en la regulación de la concentración de la enzima glutatión peroxidasa, en la peroxidación de los lipidos y en la oxidación de los grupos sulfhidrilo de la membrana celular, fenómenos que originan la hemólisis [20], tambièn participa en la regulación de la sintesis de las proteinas hem en el higado, lo que se relaciona con cierto tipo de alteraciones en la eritropoyesis y con la disminución de los àcidos grasos.

Se ha demostrado que el contenido plasmàtico de selenio en pacientes con diabetes mellitus es significativamente màs bajo [29]. Existe una correlación inversa entre la actividad de la GPx y la agregación plaquetaria, un aumento de la ingesta selenio eleva la actividad de la GPx y disminuye la sintesis de tromboxanos. Estos hallazgos avalan que la complementación con selenio ayuda a disminuir la agregación plaquetaria y previene las complicaciones cardiovasculares en estos pacientes.

Recientes estudios han confirmado que los suplementos de selenio en la dieta reducen el riesgo de varias formas de cáncer en animales y humanos, [30-31] y de otras enfermedades como el SIDA [6]. Las caracteristicas anticancerigenas del selenio se han evaluado en estudios nutricionales realizados por Clark et al [30]. Hasta la fecha el uso del selenio como micronutriente en ensayos clinicos en el hombre es limitado, pero estudios experimentales en cáncer de pecho realizados por Lavander et al [21] indican que el selenio está entre los agentes más prometedores [31].

La utilización de levaduras, como Saccharomyces cerevisiae enriquecidas con selenio como suplementos nutricionales, ha sido muy investigada [32-35]. La levadura puede asimilar durante su crecimiento hasta 3000 μg.g-1 de selenio inorgánico, biotransformándolo principalmente en SeMet [36].

Otros biotransformadores de selenio que también han sido estudiados como suplementos alimenticios contra cáncer y enfermedades cadiovasculares son las plantas Allium (cebollas, ajos, brécol), [37]. La nuez, Brazil nuts es un alimento que biotransforma hasta 35 μg.g-1 de selenio inorgánico [38-39]. El selenio también se encuentra en carne, pescado, leche, queso, mariscos, frutas y cereales. La concentración de selenio en estas fuentes dependerá de la zona geografica.

El selenio ha demostrado ser esencial para las bacterias [40-41]. Los estudios realizados por Andreani et al [42] mostraron que algunas especies de lactobacilos: Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus casei y Lactobacillus platarum, almacenan el selenio intracelular como selenio orgánico. Sin embargo el selenio en otras especies de lactobacilos Lactobacillus rhamnosus y Lactobacillus fermentum, tiene un papel funcional en la estimulación enzimática de estos microorganismos.

1.4 Toxicidaddelselenio

El selenio es tóxico cuando se ingiere en concentraciones superiores a 300 μg dia-1 [43]. Sus efectos tóxicos se conocen desde hace mucho tiempo y depende de factores como la forma quimica, la concentración y las posibles transformaciones que puedan sufrir en su interacción con el medio.

Las formas orgànicas de los elementos suelen considerarse màs tóxicas que las especies inorgànicas, por su naturaleza lipofilica, al poseer mayor facilidad para difundir ràpidamente a travès de las membranas celulares. Sin embargo, muchas especies orgànicas de selenio son esenciales y forman parte de las proteinas (SeMet, SMC y SeCys2), por lo que su toxicidad potencial es nula. Dentro de las formas inorgànicas, el selenio elemental parece ser el menos tóxico por ser el màs insoluble y por tanto difícilmente asimilable por los organismos. Las especies selenito y seleniato presentan toxicidad semejante, otorgàndoseles propiedades mutagènicas [44-45].

El selenio puede ser transportado en la cadena alimenticia hacia niveles superiores. Por ejemplo en los sistemas acuàticos, la biomagnificación de selenio oscila entre 2 y 6 ordenes de magnitud desde el productor primario (fitoplancton, algas) hasta llegar a los animales y vertebrados [46].

En el hombre se desconocen los niveles exactos para producir intoxicación crónica, pero cantidades del orden de 2-8 mg kg-1 son capaces de producir graves lesiones [44]. Se han registrado varios casos de envenenamiento por selenio con un consumo dietètico de 5 a 27 mg kg-1, o por exposición industrial a seleniuros, dióxidos de selenio y oxicloruro de selenio [47]. Los sintomas de selenosis por inhalación son mareos e irritación de las membranas mucosas. Cuando la exposición es elevada produce acumulación de liquido en los pulmones, bronquitis, neumonia, fiebre, dolor de garganta, conjuntivitis, vómitos, dolores abdominales, diarrea y expansión del higado. Cuando es ingerido puede producir pelo quebradizo y ufias deformadas, sarpullidos, calor, hinchamiento de la piel, dolores agudos.

1.5 Antecedentes sobre la especiación y cuantificación de selenio

La mayoria de las técnicas para poder cuantificar elementos traza requieren que se realice un tratamiento previo de la muestra, siendo esta la etapa más critica en la determinación [48]. La dificultad del tratamiento aumenta cuando se requiere determinar concentraciones muy bajas de las distintas especies, debido a posibles contaminaciones, pérdidas y transformaciones de las especies de los analitos a determinar. Una etapa fundamental en todo tratamiento de muestra es la selección de un método de extracción correcto [49].

Una comparación de los métodos de extracción para la cuantificación de especies orgánicas de selenio en levadura enriquecidas ha sido llevado a cabo por Yang et al [50]. Uno de los métodos de extracción más utilizados en este grupo de investigación es la hidrólisis proteica que puede ser ácida, básica y enzimática [51].

Las enzimas más utilizadas en protocolos de digestión son la pronasa K y proteasa XIV [52-53], que presentan un porcentaje de recuperación del 55-84% del selenio total que contiene la levadura enriquecida [54-56]. Cámara et al [57] han descrito el aumento de la eficacia de la extracción de selenio en el proceso de hidrólisis enzimática de dos enzimas proteoliticas (proteasa XIV y subtilisina) cuando se emplea una sonda de ultrasonidos para llevar a cabo dicho proceso en diferentes muestras biológicas.

Se han realizado diversos estudios para la extracción de especies orgánicas de selenio, utilizando técnicas ultrasónicas (extracción liquida ultrasónica (USLE), el bano ultrasónico y la sonda ultrasónica) a diferente pH [58-60].

Uno de los problemas principales, citados por diversos autores, se relaciona directamente con la recuperación cuantitativa de las especies orgánicas del selenio durante el proceso de extracción [57]. Actualmente, la metodologia basada en la digestión enzimática asistida por sonda ultrasónica (EPS) ha constituido una mejora notable, siendo capaz de extraer cuantitativamente el contenido del selenio de la levadura de forma rápida, reduciendo considerablemente el tiempo del análisis.

Técnicas analíticaspara la cuantìfìcacìóny especiación del selenio.

El nùmero de articulos publicados sobre las especies de selenio ha aumentado en màs en un orden de la magnitud durante los ùltimos 20 afios [61-62]. La versatilidad y el potencial de detección de la espectrometria de masas (MS) han sido clave en la identificación y determinación de especies de selenio a nivel de trazas en alimentos naturales y enriquecidos.

Espectrometria defluorescencia atomica (AFS)

La espectroscopia de fluorescencia atómica (AFS) es una tècnica utilizada para el anàlisis de elementos traza. Se caracteriza por su alta sensibilidad para la determinación de elementos como mercurio y selenio. En la actualidad, el empleo de llamas, como la de hidrógeno ha sido la base del resurgimiento de esta tècnica, si bien su aplicación se limita bàsicamente a elementos formadores de hidruros, aunque hoy en dia se ha ampliado a la determinación de aquellos elementos que fàcilmente se pueden derivatizar a compuestos volàtiles.

Eespectrometria de masas con plasma acoplado inductivamente (ICP-MS)

El plasma acoplado inductivamente (ICP) se caracteriza por producir suficiente energia para ionizar los àtomos. Esos iones en estado gaseoso son separados de forma especifica segùn su relación carga/masa en el analizador (cuàdrupolo) y detectados mediante un electromultiplicador dando lugar a la tècnica de ICP-MS. Los primeros trabajos realizados empleando el plasma como fuente de iones para espectrometria de masa (MS) fueron los de Houk et al. [63]. Trabajos posteriores fueron realizados por Date y Gray [61].

El ICP-MS ha revolucionado las tècnicas de anàlisis elemental. A. Sanz-Medel et al. [65], menciona las principales ventajas y aplicaciones de esta tècnica: a) Permite la aplicación de tècnicas de dilución isotópica para anàlisis cuantitativos de trazas [66], b) Especiación de trazas y ultratrazas en medio ambiente y material biológico [67], c) Marcaje con isótopos estables [68]. La desventajas màs importantes son las siguientes: a) presenta interferencias, que pueden ser isobàricas o poliatómicas, siendo estas ùltimas
las más importantes [69], debido a que son originadas por los gases del plasma [Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten] [70], por la matriz de la muestra o por los iones provenientes de los ácidos utilizados en el tratamiento de la muestra.

Otras interferencias posibles de iones poliatómicos sobre el selenio en HPLC- ICP-MS son las ocasionadas por la fase móvil. Chassaigne et al [71] han publicado 35 78 interferencias poliatómicas 12 LC y35 Cl2 en el análisis elemental de los isótopos Se y 82 Se usando Tris-HCl como fase móvil, b) Es un instrumento comparativamente muy caro (adquisición y mantenimiento) [72], c) La tecnologia de hardware y software es complicadarequiriendo un personal altamente especializado [65].

Las interferencias poliatómicas en ICP-MS se pueden eliminar utilizando la tecnologia de la celda de colisión/reacción [73]. La celda utiliza un gas auxiliar para eliminar las interferencias. Los gases que se utilizan son: hidrógeno, óxido de dinitrogeno [74], metano [75], combinaciones con metano y el amoniaco [76]. Otra solución para eliminar interferencias poliatómicas es utilizar instrumentes de doble enfoque (DF) que poseen un analizador electrostático acoplado en serie con un sector magnético (ICP-DF), este tienen un gran poder de resolución que impide el solapamiento de las senales.

El ICP-MS se utiliza por su alta sensibilidad para la determinación de trazas en la mayoria de los elementos quimicos [77] y sus limites detección son de ng kg-1 [78]. Encinar et al. [79], ha publicado limites de detección para especies de selenio inferior a 0.5 μg kg-1 en muestras medio ambientales. C. Meter et al [3] han publicado en el caso de muestra biológicas (suero humano) limites de detección de 0.5-2 μg kg-1 para selenocistina, selenometionina y selenoetionina, utilizando celda de colisión/reacción.

Técnicas de separation empleadaspara el análisis especies orgánicas de selenio

La cromatografia liquida de alta resolución (HPLC) ha resultado ser la técnica de referencia para la separación de compuestos no volátiles y térmicamente lábiles. Entre las técnicas más utilizadas está la cromatografìa de exclusión por tamano (SEC) [80], intercambio iónico [81] y fase inversa que son ampliamente utilizadas para separar proteinas, enzimas, pèptidos y aminoàcidos con rapidez y eficacia [82-84].

Estos tipos de cromatografìa se pueden acoplar con facilidad al ICP-MS dando sistemas hibridos en linea (on-line) para el estudio de especiación [85-87]. El sistema de separación se conecta directamente al detector atómico, proporcionando resultados de una elevada sensibilidad, resultados reproducibles y tiempos muchos màs cortos en comparación con los mètodos tradicionales discontinuos (off-line). Por lo que el empleo HPLC-ICP-MS en sus diferentes modalidades resulta màs sencillo para la identificación de especies orgànicas de selenio, ademàs de otros elementos a nivel de trazas [88-90].

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Details

Seiten
66
Jahr
2008
ISBN (eBook)
9783656214359
ISBN (Buch)
9783656217268
Dateigröße
2.5 MB
Sprache
Spanisch
Katalognummer
v195159
Institution / Hochschule
Universidad Complutense de Madrid – Facultad de Ciencias Química
Note
9.0
Schlagworte
evaluación

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