Einfluss der Meereshöhe auf die lithobiontische Mikrobiota in der alpinen und nivalen Höhenstufe am Beispiel des Schrankogel

Inhalt

Zusammenfassung & Abstract

1 Einleitung
1.1 Vorkommen von Mikroorganismen im Hochgebirge
1.1.1 Bacteria
1.1.2 Archaea
1.2 Bedeutung der Mikroorganismen für die Bodenbildung
1.2.1 Gesteinsverwitterung
1.2.2 Laugung

2 Zielsetzung

3 Material und Methoden
3.1 Standort und Probennahme
3.1.1 Schrankogel
3.1.2 Probennahme
3.1.3 Probenvorbereitung und Biofilmbildung
3.2 Versuchsdesign
3.2.1 Überblick des Gesamtkonzepts
3.2.2 Untersuchungen an der Extraktionslösung
3.2.3 Untersuchungen von anaeroben Mischkulturen
3.2.4 Untersuchungen an aeroben Mischkulturen
3.2.5 Untersuchungen an aeroben Reinkulturen
3.3 Analytik
3.3.1 Chemische Parameter
3.3.1.1 pH Wert.
3.3.1.2 High Performance Liquid Chromatography
3.3.1.3 Fatty Acid Methyl Ester Analysis
3.3.2 Mikrobiologische Methodik
3.3.2.1 Aerobe cfu-Bestimmung.
3.3.2.2 Optische Dichte 600 nm.
3.3.3 Molekular Biologische Methodik
3.3.3.1 DNA Extraktion..
3.3.3.2 Polymerase Chain Reaction
3.3.3.3 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
3.3.3.4 Sequenzierung.
3.4 Statistik

4 Ergebnisse und Diskussion
4.1 Untersuchungen der Extraktionslösung
4.1.1 Aerobe Keimzahlbestimmung der Steine
4.1.2 DGGE der Extraktionslösung
4.2 Untersuchungen von anaeroben Mischkulturen
4.2.1 Methanmessung im Headspace der anaeroben Mischkulturen
4.3 Untersuchungen von aeroben Mischkulturen
4.3.1 pH-Wert in aeroben Mischkulturen
4.3.2 Konzentrationen organischer Säuren in aeroben Mischkulturen
4.3.3 Konzentrationen von Fettsäuren in aeroben Mischkulturen
4.4 Untersuchungen an aeroben Reinkulturen
4.4.1 Phänotypische Unterscheidung der Reinkulturen
4.4.2 pH-Wert von aeroben Reinkulturen
4.4.3 Mikrobielles Wachstum von aeroben Reinkulturen
4.4.4 Konzentrationen organischer Säuren in aeroben Reinkulturen
4.4.5 Konzentrationen von Fettsäuren in aeroben Reinkulturen
4.4.6 Auswirkungen unterschiedlicher Temperaturen auf aerobe Reinkulturen
4.4.7 Auswirkung unterschiedlicher Nährmedien Konzentrationen auf aerobe Reinkulturen
4.4.8 Ergebnisse der Sequenzierung der PCR Produkte

5 Synopsis und Ausblick

6 Literaturverzeichnis

7 Danksagung

8 Anhang

Zusammenfassung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Gesteinsproben von unterschiedlichen Höhenstufen des Schrankogel untersucht. Die auf diesen Steinen lebenden Mikroorganismen wurden angereichert und extrahiert und es wurde die Keimzahl ausgezählt und die Diversität der angereicherten Extraktionslösung mittels denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in Abhängigkeit von der Höhenstufe bestimmt. Zur Untersuchung wurden Kulturmethoden verwendet, obwohl dies aufgrund des kleinen Anteils kultivierbarer Mikroorganismen ein Risiko der Verfälschung darstellt. In einem speziell entwickelten Nährmedium, welches einem möglichst breiten Spektrum der vorkommenden Mikroorganismen als Wachstums- grundlage dienen soll, wurden ausgehend von den Gesteinsproben Mischkulturen angereichert und aerob kultiviert. An aeroben Mischkulturen und Reinkulturen die von den CFU Platten isoliert wurden, wurde mittels High-performance liquid chromatography (HPLC) das Spektrum ausgeschiedener organischer Säuren untersucht um laugungsaktive Mikroorganismen zu erkennen. Von denselben Kulturen wurden darüber hinaus fatty acid methyl ester (FAME) Analysen durchgeführt, um über Marker Fettsäuren Rückschlüsse auf die vorkommenden Gattungen oder Großgruppen ziehen zu können. Die von HPLC und FAME Analyse erhaltenen Daten wurden anschließend statistisch ausgewertet um Ähnlichkeiten zwischen den Mischkulturen der Höhenstufen untereinander sowie innerhalb der Reinkulturen zu erkennen. Das Wachstum der Reinkulturen wurde photometrisch beurteilt und die Wirkung unterschiedlicher Temperaturen und Nährmedienkonzentrationen auf die gewonnenen Reinkulturen wurde untersucht. Zur genaueren Artbestimmung wurden ausgewählte Reinkulturen einer PCR unterzogen, die erhaltene DNA aufgereinigt, sequenziert und die Sequenz über das „Basic Local Alignment Search Tool“ einer Art zugeordnet.

Zwar zeigte keine der direkt gemessenen Größen einen signifikanten Trend anhand der Seehöhe, jedoch konnte in den Mischkulturen anhand Fettsäuremarker für Gram positive und Gram negative Bakterien ein deutlicher Wechsel der mikrobiellen Gemeinschaft im Höhenverlauf festgestellt werden und bei der Untersuchung der Wirkung unterschiedlicher Nährmedienkonzentrationen zeichnete sich die Tendenz der Zunahme von R-Strategen mit der Höhe ab. In den Mischkulturen aller Höhenstufen konnten Fettsäuremarker für Pseudomonaden nachgewiesen werden, was auf ein ubiquitäres Vorkommen von Pseudomonaden auf den Schrankogel Steinen schließen lässt. Die DGGE Analyse zeigte bei ca. 3000 m einen Wechsel der bakteriellen Gemeinschaften. Die Mehrheit der isolierten Reinkulturen zeigte bei 10° C ein stärkeres Wachstum als bei 20° C und reagierte positiv auf zunehmende Nährstoffkonzentrationen. Trotz der Verschiedenartigkeit der gewählten Ansätze und der Schwierigkeiten des kulturtechnischen Zugangs konnte in Zusammenhang mit einer Reihe von Parametern ein Wechsel der mikrobiellen Gemeinschaft oder ein anderes Reagieren in der mittleren Höhenlage aufgezeigt werden.

Abstract

Gravel probes from an elevating transect at the south west slope of Schrankogel mountain have been investigated. Microorganisms living on these stones have been enriched and extracted. Plate counts have been investigated and diversity has been analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) in the enriched extraction solution. Culture methods have been used for investigation in face of the risk of falsification due to the small percentage of cultivable microorganisms. A culture medium, specially developed to serve as nutrition basis for a broad spectrum of epilithic microorganisms, has been inoculated with the enriched extraction solution and incubated aerobically to yield on mixed cultures. High-performance liquid chromatography (HPLC) has been used to analyze the spectrum of released organic acids in the mixed cultures and pure cultures isolated from the plate count plates to recognize acid producing, thus possibly leeching microorganisms. Cultures were also analyzed by fatty acid methyl ester (FAME) analysis to draw conclusions on appearing genera and higher taxonomic groups by marker fatty acids. The HPLC and FAME data have been evaluated statistically to recognize affinities between the mixed und pure cultures of different altitudes. Growth of pure cultures has been evaluated photometric and the effect of different temperatures and concentrations of nutrients on growth has been evaluated. For exact identification of species, selected pure cultures have been undergone a polymerase chain reaction (PCR), the received DNA has been purified, sequenced and assigned to a species by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).

Despite none of the directly measured factors showed a significant altitudinal trend, the FAME analysis of mixed cultures showed, by markers for gram positive and gram negative bacteria, a clear change in microbial community with elevation. The investigation of the effect of different nutrient concentrations on the pure cultures showed an increment of R-strategists with elevation. In mixed cultures of all altitudes markers for pseudomonads could be found indicating ubiquitous appearance of pseudomonads on the stones from Schrankogel. DGGE Analysis indicated a change of the bacterial community at 3000 m. The majority of isolated pure cultures showed a stronger growth at 10° C than at 20° C and reacted positively on increased Nutrition. Despite the diverseness of the chosen approaches and the difficulties of the culture based approach, a change of microbial communities or other reacting in the middle altitude could be illustrated by a row of parameters.

1 Einleitung

Mikroorganismen sind im Verlauf der Pedogenese die ersten Lebewesen, die Gesteinsmaterial besiedeln und zu biologischen Verwitterungsprozessen führen. Damit schaffen sie die Grundlage für die weitere Besiedelung durch höhere und anspruchsvollere Organismen. Die biologische Verwitterung durch Mikroorganismen stellt damit einen wichtigen Schritt der Bodenbildung dar. Mit steigender Höhe sinkt im Allgemeinen die Luftfeuchtigkeit (Schuh 1989), die UV Strahlung wird intensiver (Drexel 1981) und die Durchschnitts-temperatur sinkt (Hann 1870). Dadurch sind Böden in höheren Lagen kürzere Zeit eisfrei und durch die kältebedingte Verlangsamung biologischer Vorgänge noch weniger weit entwickelt als tiefer gelegene gleich alte Böden. Womöglich lässt sich auch ähnlich dem „space for time substitution“ Konzepts (Pickett 1989) das für Gletscher Vorfelder gilt, die Sukzession der Mikrobiota im Laufe der Pedogenese anhand des Höhenverlaufes untersuchen. Der Einfluss der Meereshöhe und der damit verbundenen Umweltfaktoren auf die Mikrobiota wurde bereits mehrfach untersucht, wobei es zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen kam, sodass diese noch nicht als vollends verstanden gelten kann. Während Margesin et al. (2008) und Byrant et al. (2008) einen signifikanten Höhentrend feststellen konnten, kamen Wang et al. (2013) zu dem Ergebnis dass der Einfluss der Höhe nur minimal ist. Singh et al. (2013) fanden wiederum höhenabhängige Muster aber keinen eindeutigen Trend. Zhang et al. (2013) sowie Lauber et al. (2009) konnten hingegen keinerlei Höheneinfluss feststellen. In der vorliegenden Arbeit wurden Gesteinsproben von unterschiedlichen Höhenstufen des Schrankogel mittels Kultivierungsmethoden auf ihre mikrobielle Besiedelung untersucht um Hinweise auf Prozesse der Bodenbildung aus mineralischem Ausgangsgestein zu ermöglichen.

1.1Vorkommen von Mikroorganismen im Hochgebirge

1.1.1 Bacteria

Bakterien kommen im Hochgebirge aufgrund des fehlenden Bodens hauptsächlich auf Steinen und Felsen lebend (lithobiontisch) vor. Dabei unterscheidet man epilithisch (auf Steinen an der Oberfläche), hypolithisch (auf Steinen unter der Oberfläche) und endolithisch (in Steinen) lebende Organismen (Diels 1914, Cameron&Blank 1965). Die endolithischen Mikroorganismen werden weiter unterteilt in hypoendolithisch (in porösem Gestein), euendolithisch (aus eigener Kraft in Steine eingedrungen) und chasmolithisch (in Rissen in Steinen) lebende Gemeinschaften (Golubic et al 1981). Im Hypolithion kommen an Bakterien vor allem Cyanobakterien und geringe Mengen an Chloroflexi, Actinobacteria und Bakteriodetes vor (Wong et al. 2010). Im Endolithion dominieren in Dolomit Actinobacteria, Alpha Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, Chloroflexi und Cyanobacteria, in geringerem Anteil Vertreten sind auch Gamma Proteobacteria, Gemmatimonadetes und Planctomycetes (Horath und Bachofen 2008). Auf Sandstein und Kalkstein sind Actinobacteria, Cyanobacteria und Proteobacteria am stärksten vertreten, während in Granit hingegen vor allem Actinobacteria dominieren (Walker und Pace 2007).

1.1.2 Archaea

In den dolomitischen Zentralalpen konnten verschiedene Crenarcheaota in einem strukturierten endolithischen Biofilm nachgewiesen werden (Horath und Bachofen 2008). In den Rocky Mountains konnten in endolithischen mikrobiellen Gemeinschaften auf Granit, Sandstein und Kalkstein aus der Domäne der Archaea nur Crenarchaeota nachgewiesen werden (Walker und Pace 2007). Auch im Hypolithion der Quarz Deckschicht in einer Hochtundra in Zentral Tibet wurden lediglich Crenarchaeota aber ebenfalls keine Euryarcheaota gefunden (Wong et al. 2010).

1.2Bedeutung der Mikroorganismen für die Bodenbildung

1.2.1 Gesteinsverwitterung

Die mikrobielle Gesteinsverwitterung wird zur chemisch-biotischen Verwitterung gezählt und durch ausgeschiedene Stoffwechselprodukte verursacht (Blyth & De Freitas 1984). Näheres dazu findet sich im Anschlusskapitel unter „Laugung“. Die wetterbedingte Erosion von Gesteinsflächen verbessert die Bedingungen für die mikrobielle Verwitterung indem sie die Oberfläche vergrößert, frische Oberflächen freisetzt und Nischen für die Mikroorganismen schafft. Im Gegenzug verstärkt wiederum die Verwitterung der Oberflächen die Erosion, indem sie das Gestein schwächt (Riebe et. al. 2004).

1.2.2 Laugung

Unter mikrobieller Laugung versteht man das durch Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen verursachte Herauslösen von Inhaltsstoffen, meist Metallen, aus festen Strukturen, indem sie in wasserlösliche Form gebracht werden. Die mikrobielle Laugung kann über Redox Reaktionen (Redoxolyse), Komplexbildner (Komplexolyse) oder ausgeschiedene Säuren (Acidolyse) stattfinden und kann von autotrophen oder heterotrophen Organismen ausgehen (Brandl 2001).

Unter den organischen Säuren stellte sich Oxalat als besonders laugungsaktiv heraus. Die Hauptwirkung geht dabei vom Liganden aus, welcher mit Metallen Komplexe bildet (Komplexolyse). Die Säurewirkung erhöht als Sekundäreffekt die acidolytische Freisetzung von Metallen (Frey et al. 2010).

2 Zielsetzung

Ziel der Arbeit ist es zu untersuchen, ob auf der Basis von aeroben und anaeroben Rein- und Mischkulturen, die durch die Inokulation von Nährmedien mit Gesteinsproben aus unterschiedlicher Höhe entstanden, ein Einfluss der Seehöhe auf die Zusammensetzung und Beschaffenheit der lithobiontischen Mikroflora auf Gesteinsproben der alpinen und nivalen Höhenstufe festzustellen ist. Zur Untersuchung der Mikroflora wurden neben den kulturtechnischen Verfahren chemische Parameter (FAME, HPLC) und molekularbiologische Parameter (DGGE) verwendet.

3 Material und Methoden

3.1Standort und Probennahme

3.1.1 Schrankogel

Der Schrankogel ist mit 3497 m der höchste Berg der Alpeiner Gruppe, welche zur südlichen Amphibolitzone der Ötztaler Alpen gehört. Er ist aus eng verbundenen Wechsellagen von Amphibolit, Aplit und Orthogneis aufgebaut. Der Orthogneis setzt sich aus Orthobiotitgneis, Granathornblendgneis und Biotithornblendegneis zusammen, führt kirschgroße Granate und weist eine voll ausgebildete Kristallisationsschieferung auf (Hammer, 1929). Seit 1994 ist der Schrankogel eine „GLORIA Master Site“ und am gletscherfreien Südwest Hang von dem unsere Proben stammen zeichnet sich die für die zentralen Silikat Alpen typische höhenabhängige Vegetationsfolge ab (Abrate 1998; Dullinger 1998). Die durch das „Global Observation Research Initiative in Alpine Environments“ (GLORIA) Projekt umfassende Datenlage war ein Grund den Schrankogel für dieses Projekt auszuwählen. Nähere Informationen zum GLORIA Projekt sind unter www.gloria.ac.at zu finden.

3.1.2 Probennahme

Um unterschiedliche Witterungseinflüsse zu minimieren wurden alle Gesteins Proben vom Südwest Hang genommen. Das Probenmaterial wurde oberflächlich eingesammelt oder mit einer Handschaufel entnommen und in Gefrierbeutel verpackt. Die GPS Koordinaten der Probennahmepunkte sind in Tab.1 dargestellt.

Tab.1: GPS Koordinaten der Probennahmepunkte und Meereshöhe nach GPS (Genauigkeit +/- 2 bis 7 m) von Klaus Thaler.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten.

3.1.3 Probenvorbereitung und Biofilmbildung

Die Bodenproben wurden trocken in vier Fraktionen gesiebt (A: x < 2 mm; B: 2 mm < x < 6,3 mm; C: 6,3 mm < x < 11,2 mm; D: 11,2 mm < x) und von der Fraktion C (feiner Mittelkies) ca. 25 g (genaue Werte siehe Anhang Tab.A1) in sterilisierte Falcon Röhrchen eingewogen. Um oberflächliche Keimanomalien etwas zu reduzieren wurden anschließend 25 ml der Waschlösung (Zusammensetzung: Anhang Tab.2) hinzugegeben und mit dem Heidolph Reax

2 30 min lang auf Stufe 1 über Kopf geschüttelt und die Suspension abgegossen und verworfen. Die feuchten Steine wurden in den verschlossenen Falcons bei 4° C für vier Wochen liegen gelassen, wobei jeweils montags, mittwochs und freitags die Röhrchen gewendet wurden um die Steine feucht zu halten. Nach dieser Inkubationszeit wurden nochmals 30 ml der Waschlösung hinzugegeben und abermals 30 min über Kopf geschüttelt. Nachdem die Proben 10 min ruhig gestanden sind um gröbere Schwebeteilchen absinken zu lassen, wurde die Lösung (=Extraktionslösung) zum Beimpfen der anaeroben und aeroben Mischkulturen, für die DGGE Analyse und zur Herstellung einer Verdünnungsreihe für die CFU Bestimmung verwendet.

3.2Versuchsdesign

3.2.1 Überblick des Gesamtkonzepts

Eine graphische Darstellung des Gesamtkonzepts ist in Abbildung 1 zu sehen. Wie man sehen kann gehen alle Ansätze und Untersuchungen von der Extraktionslösung der inkubierten Steine aus. Der Hauptaugenmerk liegt auf der Untersuchung der aeroben Kulturen. Dem Konzept liegt die Idee zugrunde, dass sich innerhalb einiger Wochen bei kühlen Temperaturen und feuchten Bedingungen ausgehend von der natürlichen Besiedlung der Steine eine standortspezifische epilithische Mikroflora auf den Steinen ausbildet. Diese sollte mit dem zweiten Waschschritt extrahiert und anschließend untersucht werden.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten.

Abb.1: Graphische Darstellung des Gesamtkonzepts der vorliegenden Arbeit.

3.2.2 Untersuchungen der Extraktionslösung

Unter dem Laminar Flow wurden für die spätere DGGE Bestimmung 2 x 10 ml der 6 Extraktionslösung entnommen, zur Aufkonzentration der Mikroorganismen auf 2 x 1 ml abzentrifugiert und die oberen 9 ml verworfen. Die verbleibende aufkonzentrierte Probe (1 ml) wurde in einem sterilen mikro Reaktionsgefäß eingefroren. Nach dem Auftauen wurde eine Nukleinsäureextraktion mit dem PowerSoil® DNA Isolation Kit (MO BIO Laboratories, Inc.) und eine DGGE Analyse durchgeführt (siehe Abschnitt DGGE).

Weiterhin wurde 2 x 1 ml der Extraktionslösung in sterilen Reaktionsröhrchen eingefroren, sowie 100 μl der Extraktionslösung für eine Verdünnungsreihe verwendet, die auf Schrankogel Agarplatten (Zusammensetzung: Anhang Tab. 3) für die CFU Bestimmung ausplattiert wurde. Weitere 0,5 ml der Extraktionslösung wurden verwendet um anaerobe Ansätze zu beimpfen.

3.2.3 Untersuchungen von anaeroben Mischkulturen

Luftdicht verschlossene Anaerobier Fläschchen mit 50 ml DSMZ 119er Medium (Zusammensetzung siehe Anhang Tab.4) wurden mit sterilen Spritzen und Kanülen mit 0,5 ml der Extraktionslösung beimpft und je eine Probe bei 37° C und eine bei 20° C inkubiert. An diesen Kulturen wurde mit dem Perkin-Elmer SIGMA 3B Dual FID Chromatograph die Methanbildung über das CH4 im Headspace gemessen. Die verwendete Säule enthielt Porapak, als Trägergas wurde Stickstoff verwendet. Die Säulentemperatur betrug 50° C, die Injektortemperatur 100° C und die Detektortemperatur 120° C. Da Methan wurde anhand der Retentionszeit von 45s identifiziert, die Peakhöhe diente als Mengenäquivalent.

3.2.4 Untersuchungen an aeroben Mischkulturen

Erlmeyerkolben mit 50 ml Schrankogelmedium (Zusammensetzung: Anhang Tab. 3) wurden mit 100 μl der Extraktionslösung beimpft und bei 20° C für sieben Tage bei 150 Rpm geschüttelt. Im Anschluss wurden unter dem Laminar Flow 2 mal 1 ml entnommen und in sterilen Cryo Röhrchen eingefroren. Weiterhin wurden 10 ml entnommen und bei 10000 Rpm für 15 min zentrifugiert, der Überstand dekantiert, das Pellet mit 10 ml phosphate buffered saline (PBS) gewaschen, erneut abzentrifugiert und für die FAME Analyse eingefroren. Weiterhin wurde 1 ml der Mischkulturen entnommen, sterilfiltriert und mit dem partikelfreien Überstand eine HPLC unter den im Abschnitt „HPLC“ beschriebenen Bedingungen durchgeführt. In der restlichen Kulturbrühe wurde der pH Wert gemessen (siehe Kapitel pH Wert).

3.2.5 Untersuchungen an aeroben Reinkulturen

Von den CFU Platten wurden einzelne, ausgewählte Kulturen auf sterile Schrankogel Agar Platten überimpft, von diesen zum Erhalt von Reinkulturen je drei Mal in Folge mit einem Drei-Ösen-Ausstrich in Einzelkolonien aufgetrennt und die so erhaltenen Reinkulturen abermals auf Schrankogel Agar Platten ausgestrichen.

Die so erhaltenen Kolonien wurden in 50 ml Schrankogel Medium in Erlenmeyerkolben überimpft und wie schon die Mischkulturen bei 20° C bei 150 Rpm auf dem Schüttler sieben Tage inkubiert. Die so erhaltenen Reinkultursuspensionen wurden analog zu den Mischkulturen untersucht. Es wurden 2 x 1 ml entnommen und in sterilen Cryo Röhrchen eingefroren, sowie 10 ml entnommen und abzentrifugiert, das Pellet mit PBS gewaschen, erneut abzentrifugiert und für die FAME Analyse eingefroren. Außerdem wurden in den Zellsuspensionen pH-Wert und OD600 gemessen sowie nach den im Abschnitt „HPLC“ genannten Bedingungen eine HPLC durchgeführt.

Von den Reinkultur Platten wurden weiters Kolben mit Schrankogel Medium beimpft und 24 h lang bei 10° C bebrütet (die Kulturen 29_3 und 31_8 wegen des langsameren Wachstums 72 h lang) um Vorkulturen zu entwickeln. Mit diesen Vorkulturen wurden jeweils eine Eprouvette pro Reinkultur mit 1/10 konzentriertem, drei mit einfach konzentriertem und eine mit 10-fach konzentriertem Schrankogel Medium beimpft. Das Inokulum betrug jeweils 0,1 ml. Die Eprouvetten mit zehntel, zehnfach und Eine der einfachen Konzentration wurden bei 10° C inkubiert, eine weitere der einfachen Konzentration bei 4° C und eine bei 20° C. Nach einem, zwei, drei, sechs, sieben und acht Tagen wurde die OD 600 gemessen.

3.3Analytik

3.3.1 Chemische Parameter

3.3.1.1 pH Wert

Der pH Wert in den Kulturen wurde mit einem kalibrierten pH Meter 744 von Metrohm gemessen, nach jeder Messung wurde die pH Sonde mit destilliertem Wasser gespült.

3.3.1.2 High Performance Liquid Chromatography

Jeweils 1 ml der Misch- und Reinkulturen Suspension wurden in HPLC Vials sterilfiltriert (Porenweite < 0,2 μm) und eine HPLC auf einem Shimadzu Prominence HPLC System durchgeführt. Als Laufmittel diente 5 mM H2SO4. Es wurde die Säule Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) bei 65° C verwendet, die Flussrate betrug 0,7 ml min-1. Als Standard diente Bio-Rad Organic Acid Standard. Nach jeweils acht Proben wurde der Standard gemessen, um etwaige Veränderungen der Retentionszeit und Verunreinigungen zu bemerken. Die Auswertung der Daten erfolgte mit Shimadzu Lab-Solution, die Retentionszeit diente zur Identifizierung der Komponenten, die Peakfläche wurde als Mengenäquivalent benutzt.

3.3.1.3 Fatty Acid Methyl Ester Analysis

Bei der Fettsäuremethylester Analyse, wie das Verfahren auf Deutsch heißt, werden Karbonsäuren (zu denen die Fettsäuren gehören) in Anwesenheit eines sauren Katalysators durch Alkohole verestert. In Abbildung 2 ist der Vorgang schematisch dargestellt. Der erste Schritt ist die Protonierung der Säure (1) durch das saure Milieu, wodurch ein Oxonium Ion gebildet wird. Dieses kann eine Austausch Reaktion mit dem Alkohol vollziehen (2) wobei ein Zwischenprodukt gebildet wird, welches durch Deprotonierung (3) zu einem Ester werden kann. Jeder dieser Schritte ist reversibel, durch den Alkoholüberschuss steht das Reaktionsgleichgewicht jedoch stark auf der Produkt Seite. Die Gegenwart von Wasser, welches ein stärkerer Elektronendonor ist als aliphatische Alkohole, behindert die Bildung des Zwischenprodukts (Christie 1993).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten.

Abb.2: Schema der säurekatalysierten Veresterung von Fettsäuren aus Christie (1993).

Grundsätzlich muss für die Fettsäuren Analytik extrem rein gearbeitet werden. Für die Veresterung wurden nur Glaswaren verwendet die mit dem „Intensiv“ Programm der Spülmaschine (Miele Professional G7883) gewaschen und über Nacht bei 180° C ausgeheizt wurden. Die Butyl Stopfen wurden über Nacht in alkalischer Reinigungslösung (1% Mucasol der Firma Merz Hygiene GmbH in deionisiertem Wasser) eingeweicht und anschließend mit deionisiertem Wasser, danach mit Methanol und schließlich mit Hexan abgewaschen.

Die eingefrorenen Pellets der Misch- und Reinkulturen wurden nochmals mit PBS gewaschen, abzentrifugiert, mit 2 x 2,5 ml Methanol aus den Zentrifugenröhrchen resuspendiert und in verschraubbare Glaseprouvetten überführt. Es wurden 5 ml 3 M HCl in Methanol und 2 ml Hexan hinzugegeben, die Eprouvetten mit einem Butyl Stopfen verschlossen und mit einer Dichtung verschraubt. Die Ansätze wurden über Nacht bei 50° C inkubiert. Anschließend wurden die Eprouvetten mit deionisiertem Wasser aufgefüllt und die Hexan Phase mit Pasteur Pipetten in GC Vials überführt. Es wurde die Säule Equity 1 (60 m, 0,25 mm) von Supelco verwendet. Der Injektor wurde auf 250° C eingestellt, der FID auf 330° C. Das Temperatur Programm startete bei 100° C für 3 min, heizte dann bei einer Rate von 3° C pro min auf 300° C auf und blieb 15 min auf dieser Temperatur. Der Injektor war auf ein Einspritzvolumen von 5 μl eingestellt, als Trägergas wurde Helium 5.0 verwendet. Als Standards dienten FAME 37 und BAME von Sigma-Aldrich. Jeweils nach 6 Proben wurden die Standards und reines Hexan gemessen um Änderungen der Retentionszeiten und eventuelle Verunreinigungen zu bemerken. Die Auswertung der Daten erfolgte mit Shimadzu Lab-Solution. Die Retentionszeit diente zur Identifizierung der Komponenten, die Peakfläche wurde als Mengenäquivalent benutzt.

Eine Auflistung der über die Standards FAME 37 und BAME bestimmten Fettsäuren findet sich in Tabelle 2.

Tab. 2: Identifizierte Fettsäuren. Abkürzungsschema: (i/a) (zOH) CN x (y/nq) (c/t), i = iso, a = antiiso, z = Anzahl der Hydroxygruppen, OH steht für Hydroxygruppen, C steht für Kohlenstoffatome, N = Anzahl der Kohlenstoffatome in der Fettsäurekette, x = Anzahl der Doppelbindungen, y = Gamma, n = Omega, q = Omega Sequenz, c = cis, t = trans, zyklische Fettsäuren sind mit einem vorangehenden „cy“ gekennzeichnet.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten.

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