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Ist die Erweiterung des Basophil Activation Tests (BAT) um die Untersuchung der eosinophilen Granulozyten eine Bereicherung?

Projektarbeit 2015 36 Seiten

Medizin - Biomedizinische Technik

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung
1.1 Der eosinophile Granulozyt
1.1.1 Allgemeines
1.1.2 Eosinophile Granulozyten im Zusammenhang mit Allergien
1.1.3 Oberflächenrezeptoren auf den eosinophilen Granulozyten
1.1.4 Degranulation
1.2 Der Basophil Activation Test (BAT)
1.3 Zielsetzung

2 Material und Methoden
2.1 Probengewinnung
2.2 Basophil Activation Test - Protokoll
2.3 Gating der eosinophilen Granulozyten am Durchflusszytometer
2.4 Aktivierungsmarker und Positivkontrollen
2.5 Kinetik zur Inkubation bei 37 Grad
2.6 Aktivierungsmarker und unterschiedliche Allergene
2.7 Statistische Auswertung

3 Ergebnisse
3.1 Identifikation der eosinophilen Granulozyten am Durchflusszytometer
3.2 Aktivierungsmarker und Positivkontrollen
3.3 Kinetik zur Inkubation bei 37 Grad
3.4 Aktivierungsmarker und unterschiedliche Allergene

4 Diskussion
4.1 Identifikation der eosinophilen Granulozyten am Durchflusszytometer
4.2 Aktivierungsmarker und Positivkontrollen
4.3 Aktivierungsmarker und unterschiedliche Allergene

5 Zusammenfassung und Ausblick

6 Literaturverzeichnis

7 Abbildungsverzeichnis

8 Anhang

Abkürzungen

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abstract

Title. Is the additional examination of eosinophils within the scope of the Basophil Activation Test (BAT) an enrichment?

Background. Eosinophils are associated with allergic diseases. However, they are not considered in conventional allergy diagnostic.

Objective. The adaptability of eosinophils to the BAT and its use for the diagnostics of type-1-allergies has been reviewed.

Methods. Specimens were treated according to BAT – protocol. Specimens were stimulated with fMLP and aIgE-Ab for 20 minutes respectively. As possible activation markers, the MFI of CD63 (n= 19), CD69 (n =4), CD11b (n =15), FSC (n =17) and SSC (n =17) were measured and compared to the MFI in medium. Secondary, specimens (n=18) were incubated with fMLP for 15, 20, 30, 45, 60 and 120 minutes. Additionally, the level of activation markers on allergic subjects’ eosinophils (dust allergy n =2; hay fever n =3; cat allergy n =2) were compared to the level of activation markers on nonallergic subjects’ eosinophils when stimulated with the corresponding allergen.

Results. All activation markers were higher on eosinophils stimulated with fMLP instead of aIgE-Ab. However, CD69 could not be found on eosinophils. When stimulated with fMLP the highest CD63 expression could be measured after an incubation time of 60 minutes (P=0,03), the highest CD11b expression after 15 minutes (P=0,04) and the highest SSC- and FSC-signal after 20 minutes (P=0,06; P=0,02). The level of the activation markers on allergic and nonallergic subjects’ eosinophils did not differ when stimulated with the corresponding allergen. The allergens peanut, walnut and latex directly stimulated eosinophils from nonallergic subjects in the matters of the CD63 expression and the FSC-signal (P=0,02/P=0,04; P=0,03/P=0,03; P=0,01/P=0,07). Moreover, the allergens grass pollen, alternaria alternata, cat epithelium, bee venom and wasp venom directly leaded to an increase of the eosinophils’ FSC-signal (P=0,06; P=0,01; P=0,09; P=0,02; P=0,01).

Conclusion. For the additional examination of eosinophils within the scope of the BAT no extra antibodies and no modification of the protocol is needed. Thus, no extra costs would incur. However there could not be shown a benefit concerning the improvement of type-1-allergy diagnostics .

1 Einleitung

1.1 Der eosinophile Granulozyt

1.1.1 Allgemeines

Die eosinophilen Granulozyten werden zu den Leukozyten gezählt. Mit einem Anteil von null bis maximal sieben Prozent im peripheren Blut gesunder Individuen, gehören sie neben den basophilen Granulozyten zu den anteilsmäßig wenigsten Zellen unter den Leukozyten [16]. Zum ersten Mal in den Fokus der Wissenschaft gelangten die eosinophilen Granulozyten im Jahre 1879 durch Paul Ehrlichs Vortrag „Beiträge zur Kenntnis der granulierten Bindegewebszellen und der eosinophilen Leukozyten“. Ehrlich entdeckte, dass sich Blutzellen anhand ihrer Färbeeigenschaften unterscheiden ließen. So teilte er die Granula der Leukozyten in Alpha- und Beta-Granula ein. Leukozyten mit Alpha-Granula, welche sich durch saure Farbstoffe wie beispielsweise Eosin anfärben ließen, bezeichnete Ehrlich als eosinophile Leukozyten [10]. Grund für dieses Färbeverhalten der eosinophilen Granulozyten sind die vier basischen in den Vesikeln befindlichen Hauptproteine Eosinophile Peroxidase (EP), Major Basic Protein (MBP), eosinophile kationische Protein (ECP) und eosinophile-derived Neurotoxin (EDN) [32]. Neben ihrer auffälligen roten Granulierung lassen sich eosinophile Granulozyten anhand des segmentierten brillenförmigen Kernes von den anderen Zellen im peripheren Blut mikroskopisch unterscheiden (Abbildung 1).

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Abbildung 1 Eosinophiler Granulozyt im Blutausstrich; Färbung nach Pappenheim; 1000-fache Vergrößerung.

Wie der Großteil der Leukozyten haben auch die eosinophilen Granulozyten ihren Ursprung im Knochenmark. Das Zytokin IL-5, das weniger spezifische Zytokin IL-3 und GM-CSF induzieren die Differenzierung von der Stammzelle zum eosinophilen Granulozyten. Zudem fördern diese Zytokine das weitere Überleben, mögliche Aktivierung sowie Chemotaxis der eosinophilen Granulozyten. [3] Nach 103 ± 11 Stunden Reifungs- und Speicherungszeit im Knochenmark treten die eosinophilen Granulozyten in das periphere Blut (PB) über. Hier haben die eosinophilen Granulozyten eine Halbwertszeit von 18 ± 2 Stunden. Dies ist sehr kurz angesichts der Lebensdauer anderer Leukozyten (basophile Granulozyten haben beispielsweise eine Halbwertszeit von 62 ± 15 Stunden im PB). [14] [39] Im Gewebe hingegen können sie mehrere Tage, zum Teil auch Wochen, überleben. Im Vergleich zum peripheren Blut sind die eosinophilen Granulozyten im Gewebe zahlreich vertreten (1: 400) [14]. Bei gesunden Menschen lassen sich eosinophile Granulozyten hauptsächlich im Gastrointestinaltrakt finden, im geringeren Ausmaße auch im lymphatischen Gewebe. Bei pathologischen Geschehen können die eosinophilen Granulozyten auch in andere Gewebe, wie zum Beispiel die Lunge, abwandern [20].

In jüngster Zeit zeigt sich in der Wissenschaft ein steigendes Interesse an den eosinophilen Granulozyten. Während von 1911 bis 1940 im Durchschnitt zwei Publikationen pro Jahr in PudMed erschienen sind, ist seit 1960 ein erheblicher Anstieg von bis zu 1000 Publikationen pro Jahr zu verzeichnen (Abbildung 2). Dieser Anstieg hängt nicht nur, wie man zunächst vermuten könnte, mit dem generellen Anstieg an Publikationen in PubMed zusammen. Auch der Anteil der Publikationen über eosinophile Granulozyten gemessen an der Gesamtheit aller Publikationen in PubMed hat sich seit den 1960er bis dato verdreifacht [20].

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abbildung 2: In PudMed gelistete Publikationen / 5 Jahre [13]

Aufgrund des steigenden Bewusstseins über die klinische Relevanz eosinophiler Granulozyten und das noch geringe Wissen darüber hat sich 1999 in Schweden die Internationale Esoinophilen Gemeinschaft (IES) gegründet. Eine Gemeinschaft aus Wissenschaftlern und Klinikern, welche die Erforschung über die Biologie und Pathologie der eosinophilen Granulozyten zum Ziel hat und fördert [13].

1.1.2 Eosinophile Granulozyten im Zusammenhang mit Allergien

Neben zahlreichen Krankheitsbildern wie beispielsweise dem Churg-Strauss-Syndrom, eine granulomatöse Entzündung der kleinen Blutgefäße, oder den Eosinophilen Grastroenteropathien spielen eosinophile Granulozyten auch bei allergischen Reaktionen eine nicht zu unterschätzende Rolle [3] [41].

Die Pathologen Coombs und Gell teilten die Allergien in den 60er Jahren in vier Typen ein. Mit 90 % ist die Typ-1- Allergie, auch „Soforttyp-Allergie“ genannt, die häufigste Form. [31] Bei der Soforttyp-Allergie kommt es innerhalb von 30 – 60 Minuten durch die Mediatorenausschüttung der basophilen Granulozyten und der Mastzellen zu einer Reaktion des Körpers. Erst Ende der 90er Jahre fand man heraus, dass diese Sofortreaktion bei 50 % der Patienten von einer sogenannten „Spätphase“ gefolgt ist. Die Spätphase setzt zwei bis acht Stunden nach Kontakt mit dem Allergen ein und dauert ein bis zwei Tage an. Durch die Mediatorenausschüttung der basophilen Granulozyten und Mastzellen werden eosinophile Granulozyten und Th2-Lymphozyten angelockt, welche zu dem Entzündungsherd infiltrieren. Die eosinophilen Granulozyten reagieren an dem Entzündungsherd entweder direkt auf das Allergen über IgE- oder IgG-Rezeptoren oder indirekt via C3d-Rezeptoren. Es kommt zu einer zweiten Kontraktionsphase der Muskulatur und zur Ödembildung. Hierdurch kann es zu schweren langanhaltenden Erkrankungen kommen wie zum Beispiel zum chronischem Asthma. Da diese Reaktion, neben den eosinophilen Granulozyten, durch T-Zellen vermittelt wird, handelt es sich bei der Spätphase im Prinzip um eine Typ-4-Allergie [18] [27].

1.1.3 Oberflächenrezeptoren auf den eosinophilen Granulozyten

Eosinophile Granulozyten tragen eine Vielzahl an unterschiedlichen Rezeptoren auf Ihrer Oberfläche. Diese lassen sich unterteilen in Adhäsionsrezeptoren, Zytokin- und Wachstumsfaktorrezeptoren, Chemokinrezeptoren und Fc-Rezeptoren (Abbildung 2).

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Abbildung 3: Übersicht der Oberflächenrezeptoren des eosinophilen Granulozyten [32]

Mehrere Studien haben sich mit der Frage befasst, ob und welche IgE-Rezeptoren auf den eosinophilen Granulozyten exprimiert werden. Sano et al. (1999) beschreiben eine sehr niedrige Expression des niedrig-affinen IgE-Rezeptors FcεRII auf ruhenden Zellen. Intrazellulär konnte hingegen durch Permeabilisierung der Zellmembran eine hohe Expression von FcεRII untersucht werden. Bei Aktivierung der Eosinophilen zeigte sich eine schnelle Translokation der intrazellulären FcεRII an die Oberfläche der eosinophilen Granulozyten [34]. Auch der hoch-affine IgE-Rezeptor FcεRI konnte auf eosinophilen Granulozyten nachgewiesen werden, dies allerdings nur im sehr geringen Maße. Atopikern hingegen weisen eine erhöhte FcεRI Expression auf. Das Vorhandensein von IgE-Rezeptoren lässt die Vermutung zu, dass neben den basophilen Granulozyten und Mastzellen auch eosinophile Granulozyten mit IgE-induzierten allergischen Reaktion im Zusammenhang stehen [36].

Bereits in den 80er Jahren konnten Versuche zeigen, dass eosinophile Granulozyten auf das chemotaktisch hoch wirksame fMLP reagieren [43]. Dies wurde durch eine pädiatrische Studie bestätigt, in der eine fMLP-Expression auf eosinophilen Granulozyten nachgewiesen werden konnte, wobei die Expression von neonatalen eosinophilen Granulozyten signifikant höher war als die von adulten eosinophilen Granulozyten. Zudem führte bei dieser Studie die Inkubation der eosinophilen Granulozyten mit fMLP zu einer Hochregulation des Antigens CD11b [26].

Neben der Expression des Integrins CD11b [24] [12] wird die Expression des Lektinproteins CD69 [28] [21] und des Vesikel-assoziierten CD63 [17] [22] ebenfalls mit der Zellaktivierung eosinophiler Granulozyten in Zusammenhang gebracht.

1.1.4 Degranulation

Die Degranulation ist eine Form der Exozytose. Unter Exozytose versteht man das Verschmelzen von Vesikeln mit der Plasmamembran und somit das Ausschütten des Vesikelinhaltes in den extrazellulären Raum [20]. Grundsätzlich wird die Exozytose in die konstitutive und in die geregelte Exozytose eingeteilt. Die konstitutive Exozytose vollzieht sich fortwährend in allen eukaryotischen Zellen. Sie stellt einen stetigen Strom von Vesikeln dar, welche vom trans-Golgi-Netz abgeschnürt werden und mit der Plasmamembran verschmelzen. Hierbei werden beispielsweise neu synthetisierte Lipide und Proteine transportiert, welche die Plasmamembran zum Aufbau nach einer Teilung benötigt. Für die konstitutive Exozytose wird keine besondere Signalsequenz benötigt [1].

Die geregelte Exozytose hingegen, benötigt ein extrazelluläres Signal und findet sich nur bei Zellen, welche auf die Sekretion spezialisiert sind. Hierzu zählen die eosinophilen Granulozyten. Die neu synthetisierten Proteine werden ebenfalls vom trans-Golgi-Netz abgeschnürt und anschließend in sekretorischen Vesikeln gespeichert. Die sekretorischen Vesikel beziehungsweise die spezifische Granula der eosinophilen Granulozyten enthalten die vier oben bereits erwähnten Hauptproteine EP, MBP, ECP und EDN, zudem eine Vielzahl an Zytokinen, Enzymen und Wachstumsfaktoren [32]. Die sekretorischen Vesikel sammeln sich nähe der Plasmamembran und entleeren sich auf ein entsprechendes extrazelluläres Signal hin. Bei der Exozytose wird das Vesikel zum Teil der Membran, wodurch es zu einer Zelloberflächenvergrößerung kommt. Die Zelloberflächen ist allerdings nur vorübergehend vergrößert, da die Endozytose wiederum zu einer Verkleinerung der Zelloberfläche führt [1].

Im Zusammenhang mit der Degranulation eosinophiler Granulozyten ist häufig die Rede von der Piecemeal (engl. „stückweise“) degranulation (PMD). Dvorak beschrieb 1975 mit Hilfe der Elektronenmikroskopie erstmals den Prozess der PMD bei Mastzellen, basophilen Granulozyten und eosinophilen Granulozyten [8][9][25]. Die Untersuchung ultrastruktureller Veränderungen der eosinophilen Granula durch die PMD ist nach wie vor Bestandteil von Studien (Abbildung 4). Die PMD unterscheidet sich von der geregelten Exozytose in erster Linie darin, dass es zu keiner Fusion der Granula mit der Plasmamembran kommt. Somit vollzieht sich keine Gesamtentleerung der Granula zu einem Zeitpunkt. Bei der PMD kommt es zu einer stückweisen Entleerung der Granula. Dieser Prozess wird durch sekretorische Vesikel ermöglicht, welche die Proteine von der Granula zu der Plasmamembran transportieren. Es wird angenommen, dass die PMD die häufigste Form der Exozytose bei eosinophilen Granulozyten darstellt [8][20][38].

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Abbildung 4: Ultrastruktur eines humanen eosinophilen Granulozyten mit Anzeichen auf PMD. Die spezifische Granula (Gr) weisen unterschiedliche Füllungszustände auf, was von einer PMD zeugt. (A) aufgehellte Zonen im Granula-Kern, (C) Vergrößerung und verminderte Elektronendichte, (D) Rückstände des Granula-Kerns. Die eosinophilen Granulozyten wurden von gesunden Individuen isoliert, für 1h mit Eotaxin-1 stimuliert, sofort fixiert und für die Transmissionselektronenmikroskopie präpariert. Nu, Nukleus; LB, Lipidkörper. Maßstab: 500nm (A); 170nm (B-D) [38]

Neben der PMD beschrieb Dvorak die Anaphylaktische Degranulation (AND). Die AND stellt eine schnell ablaufende, explosionsartige Sekretion dar, welche mit der IgE-vermittelten Soforttyp-Allergie in Zusammenhang gebracht wird. Der Vesikel-Verkehr innerhalb der Zelle läuft hier sehr rasant ab, sodass es teilweise zu einer gleichzeitigen Fusion zwischen Granula, sekretorischen Vesikel und Plasmamembran kommt [6].

1.2 Der Basophil Activation Test (BAT)

Der Basophil Activation Test (BAT) wurde entwickelt, um bestimmte Allergien sensitiver (vor allem Medikamenten-Allergien [7]) und/oder für den Patienten sicherer nachweisen zu können. Bei häufig angewandten herkömmlichen Diagnostikverfahren wie beispielsweise dem Hauttest oder dem Oralen Provokationstest kommt der Patient, anders als beim BAT, mit dem entsprechenden Allergen direkt in Kontakt, was in seltenen Fällen zu einem anaphylaktischen Schock führen kann. Durch den BAT konnte beispielsweise die Anzahl benötigter oraler Provokationstest zur Diagnostik einer Erdnussallergie um zwei Drittel reduziert werden [35].

Bei dem durchflusszytometrischen Verfahren macht man sich die Tatsache zu Nutze, dass basophile Granulozyten allergischer Individuen spezifische IgE-Antikörper auf ihrer Oberfläche tragen. Bei dem Kontakt mit dem entsprechenden Allergen kommt es zu einer Kreuzvernetzung der IgE-Antikörper-Rezeptoren (FcεRI). Durch die Kreuzvernetzung wird eine intrazelluläre Signalkaskade ausgelöst, welche in der Degranulation endet. Bei der Degranulation wird das vorher intrazellulär auf den Vesikeln befindliche CD63 exprimiert und CD203c (CR3) hochreguliert (Abbildung 5) [2][31].

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Abbildung 5: Prinzip des BAT. (Oben) Nicht stimulierte eosinophile Granulozyten expremieren kein CD63 , da sich dies nur intrazellulär befindet. (Unten) Bei der Stimulation bspw. mit einem anti-IgE-Ak kommt es zu einer Kreuzvernetzung der IgE-Rezeptoren, zur Degranulation und dadurch zur CD63-Expression. (Rechts) Darstellung der CD63-Expression in einem Histogramm (Quelle: http://www.adr-ac.ch/en/diagnostics/bat/ [22.06.2015])

Knol et al. (1991) waren die ersten, die eine Korrelation zwischen der Expression von CD63 auf basophilen Granulozyten und der Histaminfreisetzung feststellen konnten [19]. 1998 folgte dann durch Sainte-Laudy et al. das erste auf CD63 basierende Protokoll zum Aktivierungsnachweis der basophilen Granulozyten [33].

Vor allem bei der Diagnostik von Lebensmittelallergien wie der Erdnussallergie wiesen mehrere Studien eine gute Sensitivität sowie Spezifität des BAT nach [35]. Bei der Diagnostik von Medikamenten-Allergien oder Latex-Allergien zeichnet sich der BAT vor allem durch seine hohe Spezifität aus. Bei einem negativen Testergebnis kann man in der Regel mit einer Sicherheit von über 90% davon ausgehen, dass man gegen das entsprechende Allergen nicht allergisch ist. Die Sensitivität des BAT bei der Testung von Medikamenten-Allergien oder Latex-Allergien hingegen liegt gerademal bei 50 – 75% [4][12].

Zu den Medikamenten-Allergien zählen beispielsweise Überempfindlichkeitsreaktionen bei nichtsteriodalen Antirheumatika (NSA) (unter anderem Aspirin, Ibuprofen und Diclofenac). Diese sind vor allem bei Patienten mit Asthma und chronischer Nesselsucht verbreitet. Man weiß, dass ein Großteil dieser Reaktionen nicht IgE-vermittelt sind, sondern auf der pharmakologischen Wirkung von NSA beruhen. NSA inhibieren das Enzym COX-1, was unter anderem zu einer Mediatorenausschüttung der eosinophilen Granulozyten führt [15].

1.3 Zielsetzung

Die eosinophilen Granulozyten fanden lange nur wenig Beachtung in der Wissenschaft. Inzwischen weiß man, dass sie nicht nur zur Abwehr von Helminthen dienen, sondern beispielsweise auch eine Rolle in der Pathogenese von Allergien spielen.

Die zusätzliche Untersuchung der eosinophilen Granulozyten könnte helfen, die Diagnostik von Allergien, beispielsweise hinsichtlich Sensitivität und Spezifität, zu verbessern.

In dieser Arbeit soll untersucht werden, in wie weit es aus medizinisch-technischer Sicht möglich beziehungsweise praktikabel ist, den BAT um die Untersuchung von eosinophilen Granulozyten zu erweitern. Hierzu zählen die konkreten Fragestellungen, ob für die eosinophilen Granulozyten die gleichen Positivkontrollen (fMLP und aIgE-Ak) verwendet werden können wie für die basophilen Granulozyten. Wie lange die eosinophilen Granulozyten für den Prozess der Degranulation bei 37 Grad inkubiert werden müssen und durch welche Aktivierungsmarker die Degranulation der eosinophilen Granulozyten nachgewiesen werden kann.

Neben all den medizinisch-technischen Fragestellungen, steht letztendlich die Frage des klinischen Nutzens im Vordergrund. Hierfür wurde untersucht, wie sich die eosinophilen Granulozyten allergischer und nicht allergischer Spender bei Inkubation mit unterschiedlichen Allergenen verhalten.

[...]

Details

Seiten
36
Jahr
2015
ISBN (eBook)
9783668368392
ISBN (Buch)
9783668368408
Dateigröße
1.1 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v306090
Institution / Hochschule
Duale Hochschule Baden-Württemberg Heidenheim, früher: Berufsakademie Heidenheim
Note
1,7
Schlagworte
erweiterung basophil activation tests untersuchung granulozyten bereicherung

Autor

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Titel: Ist die Erweiterung des Basophil Activation Tests (BAT) um die Untersuchung der eosinophilen Granulozyten eine Bereicherung?