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Differenzierungsnährböden im Rahmen qualitativer Analysen in der Mikrobiologie

von Milena Biegajska (Autor) Rica Maurer (Autor)

Wissenschaftlicher Aufsatz 2018 8 Seiten

Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie

Leseprobe

Differenzierungsnährböden

1. Einleitung

Zur qualitativen Analyse in der Mikrobiologie benutzt man mehrere Testverfahren, die sich die Eigenschaften von Keimen zu nutzen machen. Zu den Testverfahren zählt einmal die Ermittlungüber Differenzierungsnährböden und die Überprüfung durch eine Api-Reihe.

2. Durchführung

Es werden Fertigplatten der Differenzierungsnährböden verwendet. Pro AG wird von jeder Sorte jeweils nur ein Differenzierungsnährboden verwendet. Auf jedem Nährboden wird eine Kolonie des Luftkeims fraktioniert ausgestrichen. Der Luftkeim wurde vor der Verwendungüber mehrere Wochen mehrmals (3-5mal) fraktioniert ausgestrichen. Der fraktionierte Ausstrich wird in direkter Nähe zum Bunsenbrenner durchgeführt, um Sedimentation zu vermeiden. Für den fraktionierten Ausstrich wird die Impföse, zu Beginn und zwischen jedem Schritt, im Bunsenbrenner ausgeglüht und zum Abkühlen leicht in den seitlichen Rand des Nährbodens gedrückt. Es wird eine Kolonie des zu testenden Luftkeims mit der Impföse aufgenommen und auf dem Nährboden ein Depot angelegt, indemöfters von oben nach unten gestrichen wird. Die Impföse wird im Bunsenbrenner ausgeglüht und im Nährboden abgekühlt. Aus dem Depot heraus werden drei möglichst parallele Linien mit der Impföse entlang des Randes der Petrischale gezogen. Die Impföse wird erneut ausgeglüht und im Nährboden abgekühlt. Ausgehend aus den bereits gezogenen Linien werden erneut drei Linien mit der Impföse gezogen. Dieser Vorgang wiederholt sich so lange bis man kurz vor dem Depot angekommen ist. Die Methode des fraktionierten Ausstrichs wird für jeden Differenzierungsnährbodenübernommen. Die Nährböden werden nach dem Ausstreichen für 48 Stunden bei 30°C bebrütet. Nach dem Bebrüten wird auf den DNase-Agar etwas HCl getropft, um DNA auszufällen.

Für den API-Test werden drei Kolonien des Testkeims in ein wässriges Medium mit einer Impföse eingerührt. Die Impföse wird nach jeder Abnahme einer neuen Kolonie ausgeglüht und in sterilem Wasser abgekühlt. Mit einer Pasteurpipette wird die Suspension durch auf- und abpipettieren resuspendiert. Die Keimsuspension wird mit der Pasteurpipette in die Reaktionsgefäße des API-Tests pipettiert, bis die Reaktionsgefäße bis zur Öffnung gefüllt sind. In die letzten zwei Reaktionsgefäße ADH und URE wird ein Paraffinölfilmüber die Suspension gelegt. In die Kuhlen des Teststreifenbodens wird destilliertes Wasser gefüllt, um ein Austrocknen zu vermeiden. Der Teststreifen wird auf den Boden gelegt und mit dem Deckel verschlossen bei 30°C für 24 Stunden bebrütet. Nach der Inkubation wird in das NIT Röhrchen NIT 1 und NIT 2, in das PAL Röhrchen ZYM A und ZYM B und in das VP Röhrchen VP 1 und VP2 pipettiert und nach 10 Minuten die Ergebnisse abgelesen.

3. Ergebnisse

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 1 Ergebnisse der Differenzierungsnährboden linke Seite Staph. aureus, rechte Seite Testkeim, Art des Nährbodens von oben nach unten: Columbia-Blut, Baird Parker, Enterokokken (KAA), DNase, Mannitol-Phenolrot-Kochsalz (Chapman)

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 2 Vergleich der Columbia-Blut Agar, links Testkeim und rechts Staph. aureus

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 3 Vergleich der Baird-Parker Agar, links Testkeim und rechts Staph. aureus

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 4 Vergleich des Enterokokken Agars, links Testkeim und rechts Staph. aureus

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Abb. 5 Vergleich des DNase Agars, links Testkeim und rechts Staph. aureus

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 6 Vergleich des Chapman Agars, links Testkeim und rechts Staph. aureus

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 7 Ergebnis des API Staph Teststreifens zur Identifizierung des Luftkeims

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Abb. 8 Mikroskopbild der Gramfärbung des Luftkeims bei 400-facher Vergrößerung

4. Diskussion

Der untersuchte Luftkeim wurde mehrmals fraktioniert ausgestrichen, um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen eine Reinkultur zu erhalten, da eine sinnvolle Identifizierung nur mit Reinkulturen durchgeführt werden kann.

Unter Selektivnährböden versteht man Kulturmedien in denen nur bestimmte, nicht allzu große Mikroorganismengruppen oder sogar nur bestimmte Mikroorganismenarten oder -stämme wachsen können. Das mikrobielle Wachstum derübrigen unerwünschten Mikroorganismen wird durch die Zusammensetzung (z.B. Substrat, pH-Wert) und den Zusatz verschiedener Hemmstoffe (z.B. Azide, Tellurid usw.) und/oder eine Reihe von Antibiotika unterdrückt.7

Der Columbia-Blut Selektivnährboden wird als Nährboden für Mikroorganismen verwendet, die Bestandteile des Bluts zum Wachstum brauchen. Bestimmte Mikroorganismen können durch Hämolyse Erythrozyten zersetzen. Man unterscheidet zwischen einer α-, β,- und - Hämolyse. Bei einer α-Hämolyse erscheint auf dem Agar eine grünliche Zone, die entsteht, weil der Agar entfärbt wird und Kalium verloren geht. Die β-Hämolyse weist auf eine tatsächliche Hämolyse der Erythrozyten hin, da die Bakterien Streptolysin O oder S produzieren, welches Hämoglobin abbaut. Es entsteht eine Hämolysezone um die Bakterien. Die

Der Staph. aureus bildet auf dem Blutagar helle gelblich-graue Kolonien mit einer dunklen, grünlichen Zone (Abb.1, S.2 und Abb.2, S.3). Die Zone weist auf eine α -Hämolyse hin. Nach den Daten der Produktspezifikation des Columbia-Blut-Agars stimmen diese Merkmale mit dem von Staph. aureusüberein, wodurch der Keim positiv getestet wurde.1 Der Testkeim weist gelbe Kolonien auf und keine Hämolyse. In der Produktspezifikation gibt es keine Eingrenzung für diese Merkmale und der Test ist für den Testkeim negativ.1

Der Baird-Parker Selektivnährboden wird zur Isolation von Staphylococcus aureus verwendet. Die Zusätze des Medium fördern das Wachstum von Staph. aureus, während sie gleichzeitig das Wachstum der Begleitflora hemmen. Lithiumchlorid, Kaliumtellurit und Glycin dienen als Hemmstoffe, während Glycin und Pyruvat das Wachstum von Staph. aureus fördern. Auf dem Baird-Parker Agar wachsende Staph. aureus Kolonien sind schwarz, wegen ihrer Reduktion von Tellurit zu Tellur.2 Dies trifft bei dem verwendeten Staph. aureus im Versuch zu (Abb.1, S.2 und Abb.3, S.3) und der Test ist für Staph. aureus positiv. Der Testkeim bildet ein schwarzes Depot, bildet dann aber kaum weitere Kolonien (Abb.1, S.2 und Abb.3, S.3). Es zeigt, dass sein Wachstum durch die Zusätze im Agar gehemmt wird und es sich bei dem Luftkeim nicht um Staph. aureus handelt. Somit ist der Test für den Keim negativ.

Der Enterokokken-Agar wird zur Isolierung von Enterokokken verwendet. Dabei wird das Wachstum von grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen der Begleitflora durch Natriumazid und das Selektivsupplement verhindert.3 Der Nachweis der Enterokokken erfolgt durch die Esculin-Hydrolyse und braun-schwarze Färbung des Nährbodens durch die Bildung des Eisen(III)-esculetin-Komplexes.3 In der Produktspezifikation wird weiterhin beschrieben, dass das Wachstum von Staph. aureus stark bis vollständig gehemmt wird und die Nährbodenfarbe unverändert bleibt.3 Der Agar in dem Staph. aureus ausgestrichen wurde ist allerdings schwarz verfärbt und weist somit auf Enterokokken hin (Abb.1, S.2 und Abb.4, S.3), wodurch der Test positiv ist. Die Ursache dafür kann sein, dass die verwendete Kolonie des Staph. aureusälter und somit inaktiver ist und dass die Kolonie nicht rein war und sie auch Enterokokken enthalten hat. Bei dem Testkeim hingegen sind keine Kolonien gewachsen und der Agar hat sich nicht verfärbt (Abb.1, S.2 und Abb.4, S.3). Somit handelt es sich bei dem Testkeim um keine Enterokokken und der Test ist negativ.

Der DNase-Agar wird dazu verwendet die DNase Aktivität von Mikroorganismen anzuzeigen. Es wird nach Inkubation HCl auf den Agar gegeben, um polymerisierte DNA auszufällen.4 Dabei wird das Medium lichtundurchlässig.4 Mikroorganismen die DNA abbauen bilden klare Hemmhöfe um die Kolonien.4 Staph. aureus bildet klare Hemmhöfe nach Zugabe von HCl aus und ist somit DNase positiv, während der Testkeim DNase negativ ist, da er nach der Zugabe von HCl immer noch lichtundurchlässige Kolonien besitzt (Abb.1, S.2 und Abb.5, S.3).

Der Mannitol-Phenolrot-Kochsalz (Chapman) Agar ist ein Selektivnährboden zur Isolierung und Identifizierung von Staphylokokken. Der Selektivzusatz ist die hohe Salztoleranz der Staphylokokken (7,5%).5 Die meisten Bakterien werden bei hohen Salzkonzentrationen gehemmt. Phenolrot ist ein Farbindikator, der bei einem neutralen pH-Wert eine rosa Färbung hat. Der pH-Wert fällt durch die Säurebildung ab, wenn das Bakterium in der Lage ist Mannitol als Kohlenstoffquelle zu verwerten. Phenolrot schlägt bei sinkendem pH-Wert von rosa auf gelb um. In den weiteren Daten zur Qualitätskontrolle steht, dass sich bei Staph. aureus gelbe Kolonien mit gelbem Hof bilden und das Wachstum gut ist. Dies trifft auf den Staph. aureus in der Versuchsreihe zu (Abb.1, S.2 und Abb.6, S.4) und der Test ist positiv. Der Testkeim kann kein Mannitol als Kohlenstoffquelle verwenden, weswegen der Agar seine rosa Farbe beibehalten hat. Die Kolonien sind gelblich und nicht gut gewachsen, was daraufhin weist, dass der Keim nicht sonderlich gut bei hohen Salzkonzentrationen wächst. Der Test ist für den Keim negativ.

Bei dem durch den API-Test zu untersuchenden Luftkeim ist nur der Test im PAL-Reaktionsgefäßpositiv ausgefallen (Abb.7, S.4). Der Keim ist positiv auf die Aktivität der alkalischen Phosphatase getestet worden. Laut Literaturwert handelt es sich daher bei dem Keim mit einer 99,9%igen Wahrscheinlichkeit um Micrococcus spp. Es ist ein grampositives, aerobes Bakterium, welches in der Luft als auch auf der Hautflora des Menschen vorhanden ist. Er ist nicht pathogen und er ist Katalase- und Oxidase-positiv. Sein Temperatur- und pH- Optimum liegt bei 28°C und 7,0 pH. Damit gehört er zu den mesophilen Mikroorganismen. Der Keim kann aber auch noch bei hohen Salzkonzentrationen von bis zu 10% wachsen, welches das Wachstum im Mannitol-Phenolrot-Kochsalz Agar erklärt. Bei der Gramfärbung verhielt sich der Luftkeim positiv und bei mikroskopischer Betrachtung konnte eine runde Zellform beobachtet werden (Abb.8. S.5). Micrococcus zählt zu den Tetraden.

5. Literatur

1. https://ilias.hs-fresenius.de/goto.php?target=file_412182_download&client_id=HSF

2. https://ilias.hs-fresenius.de/goto.php?target=file_412180_download&client_id=HSF

3. https://ilias.hs-fresenius.de/goto.php?target=file_412193_download&client_id=HSF

4. https://ilias.hs-fresenius.de/goto.php?target=file_412188_download&client_id=HSF

5. https://ilias.hs-fresenius.de/goto.php?target=file_412197_download&client_id=HSF

6. https://de.wikipedia.org/wiki/Micrococcus_luteus

7. https://www.spektrum.de/lexikon/biologie/selektivnaehrboeden/60916

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Details

Seiten
8
Jahr
2018
ISBN (eBook)
9783668732759
Dateigröße
3.4 MB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v428511
Institution / Hochschule
Hochschule Fresenius Idstein
Note
2,0
Schlagworte
differenzierungsnährböden rahmen analysen mikrobiologie

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