Lade Inhalt...

Proceedings of ASPBB. Vectorscopis Sequencing, Analog Bioinformatics, and SPIM-assisted Sequencing

von Oleg Gradov (Autor) F. Nasirov (Autor) A. Yablokov (Autor) Е. Zaitsev (Autor) Orekhov F. (Autor) A. Skrynnik (Autor)

Seminararbeit 2017 95 Seiten

Informatik - Bioinformatik

Leseprobe

ВЕКТОРОГРАФИЧЕСКИЕ СИНХРО-/ФАЗО-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ ТЕХНИКИ В СПЕКТРОЗОНАЛЬНОМ / МУЛЬТИСПЕКТРАЛЬНОМ СЕКВЕНИРОВАНИИ НА АКТИВНОМ ЧИПЕ И В КАПИЛЛЯРНЫХ МИКРОФЛЮИДНЫХ СИСТЕМАХ БЕЗЛИНЗОВОЙ (КМОП-/ПЗС-) МИКРОСКОПИИ НА ЧИПЕ. АНАЛОГОВАЯ БИОИНФОРМАТИКА.

Перспективы разработок. Базовые представления. Стандарты и модели.

Градов О.В.1

Институт Энергетических Проблем Химической Физики

Насиров Ф.А.2

Институт Энергетических Проблем Химической Физики

Яблоков А.Г.3

Институт Энергетических Проблем Химической Физики

Зайцев Е.В.4

Российский химико-технологический университет им. Д. И. Менделеева

Орехов Ф.К.5

Институт Химической Физики им.Н.Н. Семенова РАН

Скрынник А.А.6 МВТУ СТАНКИН

Аннотация

Целью настоящей работы является демонстрация применимости векторных диаграмм и векторографических техник в визуализации результатов секвениро- вания в спектрозональном либо мультиспектральном режиме с использованием фазочувствительных стандартов приемопередачи данных. Предлагается также в данном контексте рассматривать выдаваемые схемами данные как дескрипторы «аналоговой биоинформатики». На данный момент апробации проведены только для регистрограмм (в реальном времени) различных типов электрофореза и методов сепарации в гелевых и частично упорядоченных средах, как в аналоговом, так и в цифровом форматах, поэтому возможно говорить исключительно о перспективах подобных разработок, исходя из механизмов и критериев подобия данных методов и устаревших классических техник секвенирования.

ВВЕДЕНИЕ

Основная масса современных методов секвенирования с применением флуоресцентных меток может квалифицироваться как спектрозональные / мультиспектральные, по принципам визуализации и дифференцирования аналитического сигнала. Это касается также технологий секвенирования на чипе. В технологии Illumina BeadArray используется принцип цветового / спектроколориметрического кодирования микросфер (3 мкм), обладающих адресацией из 23 олигонуклеотидов и пробой длиной в 50 олигонуклеотидов. Формирование отклика кодового массива (после предварительной нивелировки фона [1,2]) - т.н. «calling» [3,4] - представляет аналитический сигнал микросфер (т.н. «сырые данные»[5]), привязанный к ROI (Region-Of-Interest). В системе существует 1520 корректных используемых адресов, 272 корректных, но не используемых адресов и 4769 некорректных адресов. Их декодирующая гибридизация, по определению, должна осуществляться в позиционно-чувствительном режиме, так как стоит задача определения нахождения целевых олигонуклеотидов в заданных координатах ROI с учетом исходного расположения микросфер на расстоянии 5.7 мкм. Флуоресценция метки на бусине при цветовом кодировании, очевидно, спектрозональна, то есть - мультиспектральна, но измеряется в целевых областях флуоресценции.

Многие специальные протоколы молекулярно-биологических исследований базируются на использовании мультиспектрального мечения (multispectral labeling). Мультиспектральное мечение антител с полифлуорофорами на ДНК- основе является распространенной техникой в цитометрии и клеточной визуализации (имэджинге)[6]и картировании белков[7]. Техника мультиспектральных измерений лежит в основе протоколов исследования связывания ДНК с ксенобиотиками и их цитотоксической и антиоксидантной активности[8]. Конъюгаты ДНК-пептид используются в качестве специфичных ферментативных хемосенсоров[9]. Методы с использованием редкоземельных флуоресцентных зондов (т.н. «редкоземельная биохимия» и «токсикогенетика редкоземельных элементов») с мультиспектральной регистрацией отклика служат не только непосредственному исследованию токсического (либо модифицирующего) воздействия данных зондов на объект исследования, но и анализу опо- средования зондом или интермедиатами, образуемыми в ходе его ассимиляции, воздействия ксенобиотиков на ткань или ядерный материал и цитоплазмоны области воздействия[10].

Мультиспектральный сбор данных может осуществляться не только в видимой, но и в инфракрасной области.

Первыми работами в данном направлении являются описания техник для пептидного секвенирования, реализуемого на коротких последовательностях, ди- и трипептидах[11]. Работы по техникам инфракрасного мультиспектрального картирования при секвенировании нуклеиновых кислот авторам неизвестны, хотя лазерное сканирование в инфракрасном диапазоне применяется на практике в секвенировании ДНК на принципах электрофореза с начала 1990-х гг.[12], ПЦР-продукты измеряются методами прямого ИК-секвенирования со второй половины 1990-х гг.[13], амплификация длинных повторяющихся па- линдромных последовательностей 16s рДНК последовательно совместима с Фурье-ИК-спектроскопией (FTIR / FT-NIRS) как технологией характеризации[14], идентификация времен жизни в ближней инфракрасной (NIR) области в техниках секвенирования на базе капиллярного гель-электрофореза становится классическим подходом[15], также как ДНК-секвенирование с временным разрешением (дискриминацией) при мечении тяжелыми атомами и модифицированными ими красителями[16]. Не вызывает сомнения тот факт, что позиционирование отдельных методов как мультиспектральных либо спектрозональных было бы возможным и в ИК-области (за исключением методов МАЛДИ-МС c многофотонной диссоциацией в ИК-диапазоне, где использование лазеров с заданными длинами волн для десорбции-ионизации не позволяет говорить о мультиспектральном сборе данных при секвенировании высокомолекулярных семантид и эписемантид [17-19]), однако, вероятно, в силу отсутствия спектрозональной визуализации сигнала в инфракрасной зоне и, как следствие, использования либо аддитивного теплового детектирования одиночной метки, либо спектрального регистрирования комплекса меток или собственно семантид как таковых (частным случаем принципа «генетически-кодируемого мультиспектрального мечения»[20]является метод кодирования производными ксенонук- леиноых кислот, которые являются как метками ДНК / полифлуорофорами, так и собственно семантидами), данная терминология не используется, хотя уже общеизвестные секвенаторы IR2 использовали двухканальную схему с полупроводниковыми твердотельными лазерами (на Х=680 нм и Х=780 нм) и инфракрасным диапазоном детектирования при регистрации сигнала флуоресценции красителей, которыми метились дидезоксинуклеотиды, при разделении продуктов терминирующих реакций в гель-электрофорезе.

Формирование теоретического базиса концепции мультиспектрального се- квенирования и спектрального мультиплексирования восходит к концу 1980-х гг.[21], когда были впервые, в рамках подходов секвенирования второго поколения, интегрированы принципы фотохимии флуорофоров, мультиспектральной регистрации, прямого блоттинга или гель-электрофореза, электронного получения изображений (имиджинга) в цифровом формате и мультиплексного се- квенирования со специфическим набором зондов и праймеров. Лазерные мето ды детекции подразумевали наличие специфических красителей с откликом в различных субдиапазонах; в частности, уже ABI 373 использовал 4 красителя видимого диапазона. Наличие красителей с различным спектроколориметрическим откликом, адекватным каналам аддитивной цветовой модели или каналам компонентного видеосигнала, позволяет использовать дифференциацию и дискриминацию по данным каналам для прямой оценки содержания связавшихся с данным краси- телем кодирующих агентов в позиционно-чувствительном режиме.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Рис. 1-а: Вариант крепления секамоскопа в крейтовой стойке(С-1426), пригодной для нужд аналоговой видеобиоинформатики.

Проблема быстрого (в реальном времени) позиционно-чувствительного оценивания содержания связывающихся с носителем кода красителей может быть решена при условии использования измерительных средств, дифференцирующих и дискриминирующих данные цветовые компоненты сигнала в реальном времени, что соответствует современным трендам RTS[22](real time se- quencing - в том числе single molecule real time sequencing, SMRTS) с оптическим детектированием[23], в том числе - для модифицированных (например, метилированных[24]) носителей кода. Более точно, с биологических позиций, требующих адекватного картирования кода сиквенса in situ, можно было бы ды охарактеризовать потребность в демультиплексировании цветовых каналов в процессе мультиспектрального секвенирования как потребность в регистрации кодирующей последовательности при произвольных воздействиях (типа вышеуказанного метилирования) по всем каналам одновременно с временным разрешением по каждому каналу в отдельности in situ. Такая постановка проблематики, апеллирующая к принципам in situ секвенирования - ISS[25](имплементируемого как на специальным образом отпрепарированных тканях , так и в гель-электрофоретических техниках разделения [26,27]; как в секвенировании ДНК, так и в секвенировании РНК), в том числе - с флуоресцентным детектированием [28,29], позволяет в случае оптической регистрации реализовать мультиплексирование - демультиплексирование с аналоговым разделением по цвету / длине волны (WDM - wavelength division multiplexing). Реализация системы, выполняющей перечисленные функции, в том числе - при контактном режиме регистрации на чипе[30], и апробация на модельных препаратах является предметом настоящей статьи.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Рис. 1-б: Модульный рэк с секамоскопом типа ПБ-100,интегрируемыми в крейтовую стойку С-1426.

ВАРИАНТЫ ИМПЛЕМЕНТАЦИИ ТЕХНИКИ

Представление входных данных. При регистрации сигнала ПЗС- и КМОП- детекторами в аналоговом формате (как с помощью простейших камер - ридеров ранних поколений, так и путём использования контактных чипов с встроенными ПЗС- и КМОП- детекторами) обычно является возможным извлечение первичных данных в формате компонентного видеосигнала, в котором низкочастотная цветовая поднесущая передается автономно (без миксинга сигнала яркости и цветности), либо в формате композитного видеосигнала, в котором транслируется полный цветной сигнал, содержащий сигналы яркости, цветовой поднесущей, гашения, всех типов синхронизации (аббр. ПЦТС или CVBS), по одному каналу, единому кабелю (согласно ГОСТ 21879-88, оговаривающему содержание сигнала синхронизации в CVS). Регистрация с использованием кабелей BNC (или RCA с переходником RCA-BNC) может быть проведена с использованием в качестве оконечного приемника не монитора, а комплекса измерительного оборудования, комплексно измеряющего и визуализирующего характеристики сигналов, а по ним - свойства исследуемого объекта. Нами также была апробирована трансляция сигналов, выдававшихся чипом с первичным RCA-разъёмом по кабелю с оконечным интерфейсом под стандартом SCART (Syndicat des Constructeurs d'Appareils, Radiorecepteurs et Televiseurs), при котором транслировался одновременно спектрозональный сигнал (зеленый / красный), так и Y-канал яркости (как вход, так и выход) композитного видеосигнала; технически / физически исключалась в таком случае только трансляция по SCART протокола управления техникой в стандарте СЕС и по соответствующей двунаправленной последовательной шине в стандарте HDMI- совместимых интерфейсов с защитой от копирования (HDCP), так как исследовался и требовал анализа аналоговый сигнал, который не следовало защищать от копирования в ходе экспериментов с распараллеливанием анализа сигнала на множественные устройства вывода и копирования информации, что регламентировано в качестве частного случая применения в стандарте CENELEC EN 50157-1 (Comite Europeen de Normalisation Electrotechnique), помимо также избыточных в данном случае регламентов CEC Implementation Guidelines (внедренных HDMI Licensing). При раздельной передаче спектрозональных каналов на визуализирующие и радиоизмерительные приборы в форме компонентного сигнала не используются различные для каждого канала принципы модуляции сигналов, а также преобразование сигнала данных каналов в сигналы яркости и цветности с последующим обратным декодированием, в связи с чем метрологическое качество данного типа аналоговой передачи существенно выше. Этому, в частности, способствует возможность использования расширенной полосы частот, намного большей, чем свойственна стандартному монохроматическому сигналу яркости. Применяя в качестве регистрирующего носителя аналоговых данных мультиспектральной регистрации (с цветоделением) записывающий прибор любого формата, хранящего цвет непосредственно по цветовым координатам в цветовом пространстве RGB, можно обеспечить метрологическую, а не только колористическую корректность сохраняемых и передаваемых (на аналитическое / визуализирующее оборудование) данных.

Синхронное / фазочувствительное детектирование (lock-in) в декодировании цистронов синтетических носителей. Согласно общеизвестным данным, трансляционный PAL-стандарт, по определению, отличается построчным изменением фазы в ходе сканирования, независимо от принципов действия устройства проекции (PAL расшифровывается как «Phase Alternating Line»). Так называемый четвертьстрочный сдвиг, применяемый в данной системе, является, в сущности, сдвигом («шифтингом» в инженерном жаргоне) поднесущей от строки к строке на 1/4 периода, вследствие чего полный цикл чередования фаз поднесущей и фазы компенсации составляет 4 фрейма визуализации аналоговых данных, то есть - 4 последовательных карты / кадра. Это значит, что можно непротиворечиво к теории использовать сканирование сигнала флуоресцентноокрашенных образцов синтетических носителей кода в мультиспектральном / спектрозональном режиме с разделением по цветовым или цветоразностным каналам (RGB и его аналоги или R-Y, B-Y и их аналоги) с колокализацией окрашенных разными спектрально кодирующими красителями фрагментов. Изменение полярности структуры (поднесущей, но не только её) между фреймами не должно смещать цикличность / периодичность фаз. Циклы, кодируемые частотой, соответствующей разности частот гармоник спектра, могут нести при этом самостоятельную аналитическую информацию о скорости реакционнодиффузионных и флуоресцентных процессов в исследуемом образце / микропрепарате. Применяя поднесущие с частотами, кратными частоте строчной развертки, и фазовую коммутацию (на 180°) между её периодами (от строки к строке), можно достигнуть сверхвысокого разрешения, в пределах от 3 до 1 строки на кодирующий источник (оптический сигнал цистронного микропрепарата, находящийся на одном уровне лэддера или единой считываемой строке или линейной ячейке чипа). Частотную синхронизацию в данном случае обеспечивают тривиальным путем, вводя жесткую связь между частотами поднесущей и строк сканирования посредством нормативно регламентируемой кратности. Альтернативой является коммутация фаз (регламентированная Sequentiel couleur avec memoire / Sequentiel couleur a memoire) с двумя поднесущими, причем реализуемая черезстрочно - по третьим строкам, что обеспечивает высокую дискретизацию по фазе (0°, 0°, 180°, 0°, 0°, 180°) при использовании двух поднесущих частот, периодически чередуемых через строку сканирования (случай коммутаций от поля к полю в данном случае не рассматривается, хотя регламентируется в рамках того же стандарта). Несмотря на вполне ожидаемые в таком случае нелнейные искажения сигналов цветности - так как информация о цветоразностных сигналах передается частотной модуляцией цветовых поднесущих, в силу чего при наличии в тракте дифференциально-фазовых искажений, на вертикальных границах («колориметрических переходах» фазы) возникает резкое изменение фазы сигнала цветовой поднесущей - данная технология также может использоваться (с известными оговорками) на практике в установках транслирующего секвенирования с отображением на вектороскопах и подключаемых воедино с ними устройствах при условии использования в некоторых звеньях (см. выше) фазочувствительных / синхронных детекторов и фазочувствительных усилителей и анализаторов. Данное требование связано с тем, что, так как частота является производной от фазы по времени, эти изменения фазы сопровождаются кратковременными изменениями частоты поднесущей, приводя к искажениям спектроколориметрических характеристик карт кода, что недопустимо в корректном секвенировании и баркодинге. Так как уровень данных искажений зависит от крутизны перепада яркостного сигнала и дельты в уровнях сигнала (до и после), а во флуоресцентных и темнопольных измерениях данный уровень и данная дельта, по определению, весьма велики, с метрологических позиций, необходим учёт не критичных, если говорить о «неметрологических» приложениях, фазовых характеристик. Амплитудный детектор выделяет сигналы, примерно пропорциональные деформированной оги- бающей при полосе 7-8 МГц радиочастотного канала, образующейся в процессе квадратурного сложения синфазной и квадратурной составляющих7 (с искажениями).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Рис. 1-в: Модуль индикации секамоскопа ПБ-100 в рэке,интегрируемом в крейтовую стойку.

При фазочувствительном (либо, как в более общем случае называют этот метод - синхронном) детектировании, квадратурная модуляция может быть не помехой и источником артефактов, но средством корректирования асимметрично-фазовых искажений. Квадратурные искажения обусловлены смещением фазы несущей, следовательно, их компенсация возможна путем ее обратного смещения, которое, в случае зависимости проводимости детектора от времени, возможно имплементировать здесь (в синхронном детекторе, в отличие от ам- плитудного детектора с проводимостью зависящей от напряжения, приложенного к диоду). Так как принципы действия синхронного детектора, в сущности, эквивалентны принципам действия ключевого модулятора с ключом, синхронно отрабатывающим с частотой модулирующего сигнала, замыкающим на полупериод входного сигнала, возможно, используя узкополосный фильтр с лимитером амплитудной модуляции и фазорегулятор (вместо первого можно использовать гетеродин, синхронизируемый входным сигналом), обеспечить сдвиг фазы на угол, эквивалентный углу паразитной фазы, однако, по знаку, инвертированный относительно неё. Избегая в визуализации артефактов окрашивания цветовых («спектрозональных») переходов, возникающих обычно при несоответствии частот покоя поднесущих цветности и коммутации фазы поднесущей, можно улучшить в три раза и более квалиметрические качества результирующего измерения (что невозможно применить в случае обычного амплитудного детектора и наличия дискриминатора в декодере цветности) Так как на практике характеристика группового времени запаздывания оценивается по АЧХ (амплитудно-частотной характеристике) приемника, а плоской части данной характеристики соответствует линейный участок ФЧХ (фазо-частотной характеристики), а ФЧХ «скатов» характеризуется нелинейными участками, можно гибридизировать измерение ФЧХ на линии передачи сигналов с селективного спектрозонального флуоресцентно-детектирующего секвенатора с телеметрической трансляцией сигнала с измерением нелинейных искажений и нелинейным анализом сигнала в целом. Критичность фазового сдвига частотных составляющих сигнала и адекватного ему группового времени запаздывания состоит, в случае аффиметрики цистрона по флуоресцентным критериям, в том, что различие группового времени запаздывания ведет к искажению сигнала яркости, а при измерении переходных характеристик, а, следовательно, и частотно-контрастной функции, проявляется в изменении фронта импульса. Исключением, на котором работа фазового детектора в схеме экспериментального се- квенатора, может быть бесполезна, является только случай изменения фаз на 90 или 270°, так как детектирование не реализуемо в случае, когда ток в цепи не имеет постоянную составляющую. Синхронные или фазочувствительные детекторы работают при фазовом сдвиге 0° / 180°, а отклонение фазы на единицы градусов проявляется искажением тестовых синусквадратичных импульсов (причем речь идёт также о базовой линии и исходной полярности, так как при изменении фаз на 180°, по определению, изменяется полярность выпрямленного напряжения). Следует отметить, что нелинейность сквозной фазовой характеристики тракта, возрастающая параллельно с ростом крутизны АЧХ в области высоких частот, может приводить к «оконтуриванию» монохромно отображаемого сигнала, что может использоваться в качестве средства морфометрии вместо обработки по Киршу, Собелю, Превиту питов или лэддерно- идентифицируемых элементов в сканограмме сигнала. Колебательные процессы на плоской части кодовых импульсов общего сигнала на средней части спектра сигнала с частотой колебаний, адекватно соответствующей частотному срезу АЧХ, могут также служить опорной величиной, однако только для методов типа FRAP и иных сравнительных флуоресцентно-кинетических измерений (имеется в виду, несомненно, число периодов затухающего переходного процесса, зависящее также от тракта, следовательно, требующее учета его в калибровке аналоговой сиквенс-системы в целом). На шкале времен отклонение времени задержки, следовательно - косвенно, параметра точности измерений не должно превышать 5 наносекунд (в случае построчного изменения фазы в ходе сканирования) или 30 наносекунд (в случае менее метрологически- оптимальной - частотной модуляции)8, что может быть зафиксировано стробоскопическим осциллографом достаточно старого модельного ряда (мы использовали двухканальный типа С7-16 с модифицированной вычислительной приставкой).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Рис.2. Программная имплементация секамоскопа (ВК-1).

Передача визуализируемого сигнала. Передача может осуществляться по двум (и более) каналам, соответствующим двум (и более) кабелям, обеспечивающим трансляцию сигналов с различными колориметрическими компонентами; соответственно, речь идёт о трансляции не композитного, но компонентного сигнала. При этом, при использовании наиболее простых и хронологически ранних интерфейсных систем, поднесущая колориметрируемого (цветового) сигнала может коммутироваться раздельно к базовым колориметрируесмым компонентам - с целью уменьшения перекрестных помех или, коррелятивно, кросс-наводок.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Рис. 3: Программная имплементация вектороскопа в системеВК-1, поддерживающей также режим секамоскопа.

Надо сказать, что использование данной технологии позволяет записывать сигналы колориметрического типа дескрипторов и люксметрического / фотометрического типа дескрипторов (яркости и цвета) дифференциально, благодаря чему создается возможность анализа как количественных, так и качественных отличий аналитического сигнала продуктов секвенирования путем записи их в массив (магнитную ленту) неидентичными группами головок на точно дифференцируемых и идентифицируемых (по характеристикам сигнала) дорожках. Нами, в частности был внедрен метод, в рамках которого магнитофон типа BETACAM являлся регистратором качественных и количественных изменений в аналитическом сигнале на активном ПЗС- или КМОП- чипе. Можно построить такую мультиосциллографическую / мультивектороскопическую систему, в которой одновременно будут регистрироваться два дифференциальных колориметрических канала для по-разному окрашенных секвенируемых «аналитов» и один люминометрический / люксметрический канал количественной оценки, по которому также транслируются фазовые синхроимпульсы. Специалисту очевидно, что разностными каналами (по синему и красному, как пра- вило) в этой схеме являются каналы B-Y и R-Y, где Y - канал яркостных измерений и трансляции синхроимпульсов.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Рис. 4: Высокодостоверная (векторная узкополосная) идентификация с попаданием в сектор по центру - а. Такая регистрограмма может быть получена для однородной / однотипной по окрашиваемости и люминансу среды семантид. Регистрограмма с высоким коэффициентном неопределенности, выходом облака точек за рамки секторов или квадрантов / октантов идентификации векторограммы - б. Пример для иллюстрации принципа идентификации в смеси, где имеются как красноокрашенные, так и синие, причем различные по люминансу и тону семантиды - в.

В целях статистического анализа распределений рационально применять многоканальные колориметрические методы, соответствующие по числу каналов числу возможных спектральных под-диапазонов свечения метки. Естест- венно, номенклатура B-Y и R-Y9 не исчерпывает реальных потребностей молекулярной биологии, но является для описываемых вариаций методик секвени- рования только удачной демонстрацией принципов / технологий преобразования и передачи данных.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Рис. 5: Пример для иллюстрации принципов стехиометрического I рацио-метрического фотоколориметрического детектирования при наличиикомплементарно фиксируемых типов (например - оснований) семантид,окрашиваемых противоположными красителями.

Проблемы преобразования визуализируемых / анализируемых данных. Принципиально реализуемы несколько вариаций преобразования сигнала, от которых зависят координаты на векторограмме и коммутация вектороскопа к установке телекино- или видеосеквенирования. В случае использования коммутации фаз с двумя поднесущими (реализуемой черезстрочно - по третьим строкам для обеспечения достаточной дискретизации по фазе (0°, 0°, 180°, 0°, 0°, 180°) при использовании пары поднесущих частот, периодически чередуемых через строку сканирования), рационально использовать (и, по факту, ипользу- ется) преобразование сигнала в «псевдо-фазовый» сигнал, детектируемый раздельно или дифференциально в три цветовых колориметрируемых и один яркостный. Очевидно и естественно, что преобразование данных (аналоговых) осуществляется не изменением коммутации, а преобразователем сигнала, вход которого является входом от системы с коммутацией фаз с двумя поднесущими (см. выше), а выход - выходом компонентного / многоканальноспектрозонального сигнала произвольного формата. Преобразователи типа TDA 3300/3030, 356.../359..., а также выпускавшиеся ранее в СССР МЦ41 (на КР1021ХА3, КР1021ХА4) или ТАУРАС 61ЦТ402Д (микросхемы типа 174 ХА 33 {TDA3505,XA992} (К) К174ХА32 {TDA4555}) позволяют реализовывать указанную в тексте транскодировку форматов. Соответствующий класс устройств называют, адекватно их функции, транскодерами, хотя эквивалентные функции инверсно выполняет видеопроцессор TDA3505 (со входами для лю- минометрического / люксометрического и колориметрического дельта- сигнала) и бидекодерная система TDA4555, а также - «гибридные» однокристальные процессоры-декодеры (например - 1021ХА4 / TDA3562). Имплементируемые с их помощью методы «аналоговой биоинформатики» реального времени позволяют избежать потребности в цифровых конвертерах данных и кодеках, обеспечивающих совместимость ЭВМ установки с соответствующими файловыми форматами, являющимися продуктами предварительной, не осуществляемой, по определению, в реальном времени оцифровки. К сожалению, множество подобных приборов, специально адаптируемых для видеосеквенирования, является в данное время патентоёмким предметом интеллектуального права и, исключая ссылки на служебные документы, не находящиеся в открытом доступе, не может быть рассмотрено здесь.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Рис. 6: Пример различия по люминансу в профилях колориметрически от-личных каналов для иллюстрации принципа неидентичности высвечивания при селективном окрашивании (данный пример, заимствованный из сетевых источников, выполнен не напрофиле сиквенса семантид и носит исключительно учебный характер).

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Channel Plot GxB

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

Channel Plot GxR

Рис. 7: Независимость принципов корреляционной спектрозональной коди-ровки от координат визуализации. Не только в координатах делимой насекторы окружности, не только в полярных координатах, но также в пря-моугольных координатах R-G-B значение угла к осям как метрологическогои диагностического дескриптора сохраняется.

Проблемы спектрально-фазовой идентификации отдельных каналов строчной развертки видеосеквенатора. Одними из распространенных красителей генетического назначения либо одними из источников возбуждения (в зависимости от использования позитива или негатива в анализе кинетического видеоси- квенса) являются красные красители. Первые системы были «заточены» под гелий-неоновые лазеры красного диапазона. Неспецифичными красителями в колориметрической калибровочной кассете являлись наиболее элементарные красители, по спектральным критериям вписывающиеся в красный канал - такие, как родамин. Инверсия и «негативизация» цветового изображения позволяла работать как со спектрозональными либо выделенными и бинаризованными по градиенту паттернами абсорбционного режима работы (поглощение), так и с прямыми паттернами эмиссионного анализа (обычно флуоресценция). Ниже нами будет рассмотрена фазовая разностная аналитика на красном канале. При подаче сигнала цветности R-цветоразностный сигнал повторяется в следующих строках с поворотом фазы на 180 градусов. Для устранения фазовой ошибки декодер складывает текущую строку и предыдущую (из памяти10 ), благодаря чему устраняет фазовые ошибки, типичные для ряда имплементаций видеосек- венаторов на системах NTSC. При сложении двух сигналов взаимно уничтожаются R-цветоразностные компоненты из-за изменения знаков. При вычитании двух сигналов взаимно уничтожаются (видеоинж. жарг.: «аннигилируются») B- компоненты, вследствие чего, на выходах сумматора-вычитателя получаются разделённые сигналы U и V, являющиеся, по существу, масштабно изменёнными R-Y и B-Y. Следует подчеркнуть, что «ошибающиеся» и требующие подобного рекодирования системы NTSC-типа являются предшествующими для систем фазового типа (PAL), что позволяет говорить о частичной совместимости форматов в случае видеосеквенирования того и другого типа.

По существу, модуляция по амплитуде поднесущей двумя разностными сигналами при использовании данного подхода производится путём квадратурной модуляции, при которой поднесущая делится на две составляющие, сдвинутые одна относительно другой по фазе 90°. Одна компонента модулируется R-разностным сигналом, другая компонента B-разностным, а несущая частота модулированных таким путём сигналов полностью подавляется, оставляя только боковые полосы. В случае коммутации фаз с двумя поднесущими (черезстрочно - по третьим строкам для обеспечения дискретизации по фазе (0°, 0°, 180°, 0°, 0°, 180°) на паре поднесущих частот, периодически чередуемых через строку сканирования), фазовый анализ является технически-сопряженным с колориметрическим, поскольку в период / фазу, когда в строке А1 передается или считывается сигнал R-спектрозонального канала, в строке А2 идет передача или считывание B-спектрозонального канала, в строке А3, соответственно, передача или считывание G-спектрозонального канала и далее по циклу по всей площади развертки. В качестве импульса синхронизатора в фазовых системах использу ют подачу 8-10 импульсов / периодов колебаний опорного генератора на заднем плато строчного гасящего импульса, что может рассматриваться как возмущение (burst) поднесущей цветового сигнала («colorburst»), обладающее определенными фазовыми свойствами. В противовес NTSC, где фаза импульсов такого типа инвариантна (константна)11, в PAL она изменяется от строки к строке на 90°, неся информацию о фазе R-компоненты поднесущей. В целях удаления частей спектра сигналов в диапазонах поднесущих частот используют, в большей части работ, режекторные полосовые фильтры.

Следует отметить, что при кабельной передаче / трансляции сигнала детектируют радиочастоты в диапазоне метровых и дециметровых волн, как правило, с использованием транспондеров / мультиплексов, по сравнению с абсолютными частотными диапазонами приёмопередачи или радиочастотного канала в целом, частота полосы которых пренебрежительно мала (диапазон, в принципе, может не иметь стандартизированных значений радиочастотных границ). В этом случае целесообразно говорить о частотной модуляции.

Строго говоря, модуляция поднесущей разностными сигналами использует, стандартно, частотную модуляцию, причем поднесущие частоты находятся внутри диапазона частотного спектра яркостного сигнала, поэтому при приеме цветного изображения на экране становятся заметными помехи от поднесущих (в аналоговых системах с перекрестными искажениями по каналам цветности и по поднесущим, в частности), которые можно использовать как метрику пространственной калибровки мониторируемого паттерна. В случае коммутации фаз с двумя поднесущими (по третьим строкам для обеспечения дискретизации по фазе (0°, 0°, 180°, 0°, 0°, 180°) на паре поднесущих частот, периодически чередуемых через строку сканирования), возникает дополнительная помеха в силу биений поднесущих частот сигналов цветности. В связи с этим, в NTSC применяются не цветоразностные сигналы, а их линейные комбинации, поскольку неискаженная независимая передача двух видеосигналов, передаваемых методом квадратурной модуляции, возможна только при сохранении квадратуры, т.е. - сдвига между сигналами, равного 90°. Таким образом, речь, в некотором смысле, идет и о квадратурной, и о частотно-фазовой модуляции. При этом, исходя из данных спектроскопии сиквенс-сигнала, можно определять характеристики аналита через характеристики сигнала его детестирования (номинальная ширина полосы частот люминометрического либо люксометрического сигнала составляет 4,2 МГц, колориметрическая поднесущая модулируется двумя цветоразностными сигналами, один из которых транслируется в полосе частот 0...600 кГц, занимая две боковые полосы, а второй транслируется в по лосе частот 0..1.4 МГц с частично подавленной верхней боковой полосой). Зная спектр сигнала яркости, можно получить информацию в моноканале за счет суммации / наложения спектра колриметрируемого сигнала на поднесущей частоте на спектр сигнала яркости и последующего дифференциального анализа (колориметрируемый сигнал может быть получен из сигналов RGB-цветов сложением в определенной пропорции: R - 30%, G - 59% и B - 11%; в то же время сигнал люксметрии / люминометрии соответствен монохромному сигналу (произвольному или т.н. «черно-белому», для которого спектральносопряженные колориметрические свойства не имеют значения, хотя регистрация ведется, для некоторых задач, с использованием цветных или, как минимум, спектрозональных фильтров, в простейшем случае - байеровского типа).

По существу, проблема идентификации последовательностей биополимеров по данным «аналоговой биоинформатики» сводится к проблеме обнаружения и идентификации сигнала, соответствующего той или иной модуляции, соотносимой с колориметрическими опорными данными. При этом результаты идентификации должны быть инвариантны к полярности, так как полярность модуляции видеосигнала определяет, какой уровень соответствует «чёрному фону», а какой - «белому» источнику свечения; при этом полярность модуляции может быть «негативной» и «позитивной» (при негативной полярности максимальная яркость / «уровень белого» соответствует минимальной амплитуде модуляции волн несущих, а при позитивной максимальной амплитуде модуляции. Для декодирования позитивной модуляции аналоговой регистрограммы возможно использовать устройства с цепью-инвертором импульсных помех и, соответственно, импульсных по природе сигналов, в которых т.н. «порог инвертирования» варьировался регулятором, выполненным в формате агометра / потенциометра / реостата. На отображаемом монитором паттерне (при низком люксметрическом пороге) соответствующие зоны или паттерн в целом могли визуализироваться в формате негатива. Нами применялись в данных работах не устройства производства Великобритании и Франции 1960-х гг, и даже не их аналоги по принципиальной схеме, а автономные блоки на современных микросхемах с питанием, подаваемым по универсальной серийной шине, USB (разработка Ф.А. Насирова).

Секамоскопическая аналоговая биоинформатика на базе кросс-коммутации фаз с двумя поднесущими. Существенную долю доступного парка оборудования, которое оптимально по техническим характеристикам для имплементации подходов «аналоговой биоинформатики», как показывает практика, составляют устройства с коммутацией фаз с двумя поднесущими в рамках стандарта «последовательного оцветнения с памятью», отличающиеся полярностью модуляции (SECAM-L - позитивная, SECAM-K1, SECAM B/G, SECAM D/K - негативная), а также техническими деталями в записи (например, использованием дополнительного, как и в системах PAL, гетеродина для переноса спектра сигнала в низкочастотную область стандарта MESECAM, причем сохраняются избыточные для стандарта фазовые данные, тогда как для имплементации SECAM позитивным моментом является именно отсутствие избыточных для передачи паттерна данных и, соответственно, упрощенная конфигурация, при использовании которой в аналоговых декодерах не требуется использование кварцевого резонатора, а линия задержки, работающая в ультразвуковом диапазоне, может иметь некритические отклонения времен задержки до 30 наносекунд, а не до 5 наносекунд как в случае фазовой регистрации в системе PAL, дословно дешифруемой как построчное изменение фазы). Как следствие этого, в качестве регистратора аналитического сигнала целесообразно использовать секамоскопы, а не стандартные вектороскопы (в случаях, когда исходный сигнал соответствует физическими параметрами требованиям стандарта SECAM).

Стандартная работа с секамоскопом (а таких приборов сохранились единицы), согласно регламентам видеоинженерии 1970-х - 1990-х гг. (и до начала 2000-х включительно) имеет в качестве оконечного результата и промежуточных целей следующие позиции: определение и расшифровку (по визуализации на электронно-лучевой трубке) амплитудной характеристики тракта; построение амплитудных характеристик при различных положениях коммутататоров гамма-корректоров (по сигналу градаций яркости, соответствующему лэддер- ным методам на чипе при анализе методами «аналоговой биоинформатики се- камоскопического сиквенса»), в ходе чего также реализуется калибровка устройства; контроль монохромных сигналов (если речь идёт о контрастиметриче- ском пороговом детектировании, в частности) с кодирующими устройствами и блоками синхрокомплекта (со специальными генераторами, но при нажатой кнопке отключения частотной модуляции в кодирующем устройстве); контроль сигналов по метрологическим и квалиметрическим критериям при распределении сигнала с усилителей - распределителей с выхода монтажного комплекса на коммутатор, причем на выходе кодера сигнал распределяется на секамоскоп, с одного из коммутаторов сигнал подается на монитор и установку контроля параметров, а на входы второго подаются сигналы камер регистрации, что подаются на монтажный комплекс (элиминируемый из комплектации системы в случаях элементарных экспериментов по видеосеквенированию / телесеквени- рованию); кодирование в стандарт MPEG при оцифровке регистрограмм (сигнал подается на секамоскоп, модулятор аналоговой головной станции и кодер MPEG-2, на выходе которого действует транспортный однопрограммный поток по интерфейсу ASI, причем секамоскоп предназначается в системах такого рода для контроля выходного сигнала). Так, приложение В регламента (информационное) гласит следующие позиции12.

Работа с секамоскопом.

Секамоскоп ПБ-100 предназначен для: измерения размаха ПЦТС и уровней его составляющих. Секамоскоп имеет два режима синхронизации - внутренняя и внешняя синхронизация. При внешней синхронизации на вход синхронизации секамо- скопа подаётся сигнал синхронизации приёмников (ССП) от- рицательной полярности размахом 2-3 В. Внутренняя синхронизация обеспечивается за счет выделения синхроимпульсов из измеряемого ПЦТС. Переключение режима синхронизации осуществляется коммутатором «Внеш./Внутр.» в блоке синхронизации ПВ-177. У секамоскопа есть 2 входа ПЦТС. «Вход I» - находится на задней панели. «Вход II» - на передней панели в блоке ПВ-171. Переключение между входами осуществляется с помощью коммутатора входов на этом же блоке.

Передняя панель В блоке ПВ-171 есть коммутатор, с помощью которого ПЦТС проходит разные цепи этого блока. Например, при нажатии на кнопку «ЕМ» на экране секамоскопа будет отображаться ПЦТС. При нажатии на кнопку «ЕУ» на экране будет яркостный сигнал. При нажатии на кнопку «ЕС» - сигнал цветности, при нажатии «ЕАМ» и «ЕКОР» демодули- рованные сигналы цветности до фильтра «клёш» и после него соответственно. При нажатых кнопках с индексом «Е» производятся измерения амплитуд и уровней, выраженных в вольтах, при нажатых кнопках с индексом «Е» - измерение частот и девиаций. В блоке формирования ПВ-176 производится выбор длительности измеряемого сигнала при нажатой кнопке «СТРОБ.» секамоскоп отображает две строки, выбираемые с помощью кнопок «быстро вверх», «медленно вверх», «медленно вниз», «быстро вниз».

В режиме «вертикальное поле» на экране секамоскопа отображается красные и синие строки в интервале всего поля. В режиме «КАДР» - два поля. В режиме «СЦС» - сигналы цветовой синхронизации, передаваемые в полевых гасящих импульсах ПЦТС системы SECAM. Выбор 17,18 и 330,331 строк в секамоскопе не имеет жесткой привязки к той или иной кнопке, переход от одной пары испытательных сигналов к другой производится путем переключения кнопок «ИС-I», «ИС-II». Для удобства проведения измерений в секамоскопе используется измерительная линия. В ручном режиме работы уровень измерительной линии изменяется с помощью регуляторов «НАСТР.» и «НАСТР.» на блоке ПВ-172. В автоматическом режиме измерительная линия автоматически выравнивается с уровнем того участка сигнала, на котором находится стробирующий импульс.

Управление местоположением стробирующего импульса производится с помощью регулятора «СТРОБ.»на блоке ПВ-177 Переключение режимов работы осуществляется с помощью коммутатора «Авт./Ручн.» в блоке автоподстройки ПВ-172. Уровень измерительной линии показывается на электронном табло, расположенном под экраном секамоскопа.

[...]


1 Вклад автора: написание введения с библиографическим обзором и базовая идеология подпроекта; тех. ред.

2 Вклад автора: создание системы вывода сигнала картирования с чипов на осциллографические регистраторы.

3 Вклад автора: создание гистохимической инфраструктуры, пригодной для окрашивания XNA и гелевых сред.

4 Вклад автора: написание в SCADA-системе GUI-оболочки для стереогониометрического анализа на чипе.

5 Вклад автора: подбор дидактических иллюстраций в сети, компиляция объяснений принципов и стандартов.

6 Вклад автора: предложена техника сканирования продуктов сепарации во вращающемся капилляре (не SPIM).

7 Речь в данном случае идёт не о системе кодирования SECAM, целиком отвергающей «двойную квадратурную модуляцию», передающей сигнал яркости через линию задержки, а цветоразностные сигналы по «кодирующей матрице» передающей видеосигналы на фильтр предыскажений через более низкочастотные блоки, чем полоса яркости и общая полоса сигнала (до 1.5 МГц для цветоразностного сигнала R-Y либо Y-B против 5 либо 6 МГц полосы сигнала яркости, 5.5 или 6.5 МГц несущей звука и 7 или 8 МГц полосы канала в целом - в зависимости от индекса L, K1, B/G или D/K).

8 Изложение принципов действия систем декодирования сигнала приведено по изданию: Лаврус В. С. Практика измерений в телевизионной технике. Москва - Киев: СОЛОН - Наука и техника, 1996, 192 с.

9 Недостающая информация о зеленом G канале извлекается вычитанием цветоразностных колориметрических сигналов (т.е. B-Y и R-Y) из яркостного «люминометрируемого» или «люксметрируемо- го».

10 В аналоговых видеосеквенаторах вместо памяти разностно-спектрозональной развертки по строкам возможно использовать ультразвуковую линию задержки, субституирующую функции оперативной памяти RGB-строк. Для правильного суммирования и вычитания необходимо, чтобы прямой и задержанный сигналы находились в фазе или в противофазе. Это достигается только в случае задержки на целое число полупериодов поднесущей.

11 Два разностно-колориметрических сигнала, поступая раздельно на модуляторы (которые, с точки зрения радиотехники, спроектированы по балансной схеме), модулируют напряжение одной поднесущей частоты, но фазы напряжений сдвинуты на 90 градусов. Это означает, что выходные напряжения модуляторов пропорциональны произведениям входных напряжений, а поднесущая частота активно подавляется. Выходные напряжения модуляторов подаются в блок сложения и образуют полный сигнал цветности, который изменяется как по амплитуде, так и по фазе, тогда как амплитуда колориметрируемого сигнала «цветности» определяется насыщенностью, а фаза сигнала - оном.

12 Источник: http://5fan.ru/wieviob.php?id=16261

Details

Seiten
95
Jahr
2017
ISBN (eBook)
9783668892460
ISBN (Buch)
9783668892477
Sprache
Slowenisch
Katalognummer
v454494
Note
Schlagworte
proceedings aspbb vectorscopis sequencing analog bioinformatics spim-assisted

Autoren

  • Oleg Gradov (Autor)

    7 Titel veröffentlicht

  • F. Nasirov (Autor)

  • A. Yablokov (Autor)

  • Е. Zaitsev (Autor)

  • Orekhov F. (Autor)

  • A. Skrynnik (Autor)

Teilen

Zurück

Titel: Proceedings of ASPBB. Vectorscopis Sequencing,  Analog Bioinformatics, and SPIM-assisted Sequencing