Lade Inhalt...

Gentechnische Produktion von Insulin

Hausarbeit 2001 10 Seiten

Biologie - Genetik / Gentechnologie

Leseprobe

Inhalt

1. Einleitung

2. Insulin
2.1. Eigenschaften
2.2. Funktion im gesunden Organismus
2.3. Insulinmangel: Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit)
2.3.1. Auslöser
2.3.2. Symptome

3. Gentechnik
3.1. Gentechnikgesetz
3.2. Werkzeuge
3.2.1. Restriktionsenzyme
3.2.2. DNA-Vektoren
3.2.3. Wirtsorganismen

4. Beschaffung des Insulins
4.1. Tierisches Insulin
4.2. Synthese im Genlabor
4.2.1. Escherichia coli (E. coli)
4.2.2. Spezielles Verfahren

5. Quellenverzeichnis
Gentechnische Produktion von Insulin

1. Einleitung

Das wichtigste erklärte Ziel der Gentechnik ist ,,die Erforschung, Herstellung und Prüfung von Medikamenten und Impfstoffen gegen bisher schwer oder nicht therapierbare Krankheiten." (Quelle b)

Mittlerweile existieren auf dem Arzneimittelmarkt bereits weit über 300 Medikamente, die aus nur etwa 20 gentechnisch hergestellten Substanzen bestehen. Am häufigsten benötigt wird - neben EPO (Erythropoietin) für Dialysepatienten - Insulin.

Insulin war im Jahre 1982 das erste gentechnisch hergestellte Präparat, das auch zur Behandlung zugelassen wurde.

Die gentechnische Herstellung eines Proteins ist meistens die einzige Möglichkeit, den Stoff in ausreichenden Mengen zu erhalten.

Da mittlerweile ca. 160 Millionen Menschen auf der ganzen Welt allein an Diabetes mellitus erkrankt sind (also wegen ihrer Zuckerkrankheit fremdes Insulin benötigen), nimmt nicht nur die medizinische, sondern auch die wirtschaftliche Bedeutung von diesen Präparaten stetig zu.

2. Insulin

2.1. Eigenschaften

Insulin gehört zu den drei Hormonen, die in der Bauchspeicheldrüse (Pankreas) gebildet werden. Doch nur die Zellen des Inselorgans (also die Langerhansschen Inseln) sind für die Hormonbildung verantwortlich. Sie stellen nur 1-3% des Gesamtgewebes dar.

In den A-Zellen wird Glucagon, in den B-Zellen Insulin und in den D-Zellen Somatostatin produziert.

Insulin ist ein Protein, das aus 51 Aminosäuren besteht, dass heißt eigentlich relativ kurz ist.

21 dieser Aminosäuren bilden die soge nannte A-Kette, die übrigen 30 Aminosäuren die B-Kette. Diese beiden Ketten sind durch zwei Disulfidbrücken miteinander verbunden. Eine weitere Disulfidbrücke liegt innerhalb der A-Kette.

Abbildung in dieser Leseprobe nicht enthalten

(Bildquelle: g)

Doch zunächst wird von den B-Zellen der Langerhansschen Inseln das Prä-Proinsulin gebildet, das aus 107 Aminosäuren besteht.

Danach werden 26 dieser Aminosäuren abgespalten, so dass eine weitere Vorstufe des eigentlichen Insulins entseht, die Proinsulin genannt wird. Sie besitzt zusätzlich zur A- Kette und B-Kette des entgültigen Insulins noch eine dritte Aminosäurekette, das C- Peptid.

Das C-Peptid sorgt für den richtigen Aufbau des Insulins und für die Bildung der Disulfidbrücken. Wenn der Aufbau fertig ist wird das C-Peptid abgespalten und das Insulin kann aktiv werden.

Mit Hilfe dieses C-Peptids kann man die Aktivität der Bauchspeicheldrüse messen. Man muss lediglich die Konzentration des C-Peptids im Blut messen und kann dann mit diesem Messwert die Menge des gebildeten Insulins ausrechnen.

Für Diabetiker, die mit Insulin behandelt werden, ist diese Methode sehr wichtig. Die normale Insulinproduktion liegt bei ungefähr 1,8 Milligramm pro Tag; das entspricht ca. 40 Insulineinheiten.

Zu den chemischen Eigenschaften des Proteins ist zu sagen, dass in stark saurer Lösung die Denaturierung des Insulins stattfindet, die Renaturierung jedoch möglich ist (reversibel).

In alkalischer Lösung (ab dem pH-Wert 11) findet - wie im Sauren - eine Denaturierung statt, die jedoch irreversibel ist.

Zwischen dem pH-Wert 4,3 und dem pH-Wert 6,8 ist Insulin nur schwer löslich. Der isoelektrische Punkt liegt bei dem pH-Wert 5,3 bis 5,4.

2.2. Funktion im gesunden Organismus

- ,,Insulin fördert den Transport von Glukose zu allen Zellen des Körpers.
- Insulin aktiviert in der Leber und in den Muskelzellen Enzyme, die für die Verbrennung von Glukose und die Verarbeitung von Glukose in Glykogen verantwortlich sind.
- Insulin sorgt in den Fettzellen für die Aktivierung von Enzymen, die zur Umwandlung von Glukose in Fett notwendig sind.
- Insulin hemmt den Abbau von Fett.
- Insulin hat einen wachstumsfördernden Effekt.
- Insulin fördert die Bildung von Eiweißen, indem es die Aufnahme von Aminosäuren in die Zellen unterstützt.
- Insulin hemmt in der Bauchspeicheldrüse die Bildung von Glukagon.
- Insulin unterstützt die Versorgung der Zellen mit Mineralstoffen." (Quelle g)

2.3. Insulinmangel: Diabetes mellitus (Zuckerkrankheit)

Bei Zuckerkranken (Diabetikern) ist der Kohlenhydrat-, Fett- und Eiweißstoffwechsel

- wegen mangelnder Insulinproduktion oder übermäßiger Produktion der Hormone Glucagon oder Adrenalin (Gegenspieler des Insulins) - gestört.

Daraus folgt, dass der Blutzuckerspiegel immer höher steigt und dass sowohl Eiweiß als auch Fett verstärkt abgebaut wird.

Die Störung des Fettabbaus - und dadurch eine erhöhte Konzentration von organischen Säuren im Blut - kann sogar zur Bewusstlosigkeit führen.

Der ,, Typ 1" des Diabetes mellitus ist durch einen absoluten Insulinmangel gekennzeichnet, der durch eine Zerstörung der B- Zellen verursacht wird.

Als ,, Typ 2" des Diabetes mellitus werden alle Formen bezeichnet, die durch vorwiegende Insulinresistenz bis hin zu sekretorischen Defekten - einschließlich einer Insulinresistenz - gekennzeichnet sind.

In der Gruppe ,, Typ 3" werden sämtliche anderen spezifischen Typen des Diabetes mellitus zusammengefasst.

2.3.1. Auslöser

Die Zuckerkrankheit ist häufig erblich bedingt. Aber auch qualitative Überernährung, Übergewichtigkeit, ungenügende körperliche Betätigung, körperliche und seelische Belastungen (Stresssituationen) oder Störungen in der Hypophyse können Ursache für Diabetes mellitus sein. Sogar durch Drogenkonsum oder auch in der Schwangerschaft kann man an Diabetes mellitus erkranken.

,,Diabetes mellitus Patienten müssen lernen, die tägliche Insulinzufuhr je nach Nahrungsaufnahme zu bemessen und auf Symptome einer Ü berzuckerung (...) bzw.

Unterzuckerung (...) angemessen zu reagieren." (Quelle a)

2.3.2. Symptome

Durst: Der überschüssige Zucker (>180 mg Glukose pro 100 ml Blut) muss mit dem Harn abgegeben werden. Daher erhöht sich der Harndrang (Glukosorie). Der Wasserverlust des Körpers führt zu Durst (Polydipsie).

Gewichtsverlust: Wegen des Glykogenmangels in den Zellen wird der Energiebedarf des Körpers durch gespeicherte Eiweiße und Fette gedeckt. Daher führt Diabetes mellitus zu erheblichen Gewichtsverlusten trotz vermehrter Nahrungsaufnahme (Polyphagie). Leistungsminderung: Da immer mehr Glykogen der Muskeln zu Glukose abgebaut wird, dieses Glykogen jedoch für die Tätigkeit der Muskeln nötig ist, fühlt sich der Diabetiker oft müde und matt. Seine Leistungsfähigkeit sinkt rapide ab.

Schlecht heilende Wunden, Hautjucken (vornehmlich im Gebiet der Geschlechtsorgane), Gefäßleiden (die zu Durchblutungsstörungen führen), Sehstörungen und Verfettungen (Arteriosklerose) sind nur einige der Hauptsymptome.

3. Gentechnik

3.1. Gentechnikgesetz

Das Gentechnikgesetz (GenTG) ist am 1. 7. 1990 in Kraft getreten (in der Fassung vom 16. 12. 1993).

Es soll Leben und Gesundheit von Menschen, Tieren und Pflanzen sowie der sonstigen Umwelt vor möglichen Gefahren gentechnischer Verfahren und Produkte schützen und dem Entstehen solcher Gefahren vorbeugen.

Das GenTG ist der rechtliche Rahmen für die Erforschung, Entwicklung und Nutzung der wissenschaftlichen, technischen und wirtschaftlichen Möglichkeiten der Gentechnik in Deutschland.

Die Errichtung und der Betrieb einer gentechnischen Anlage, die Durchführung gentechnischer Arbeiten, etc. müssen bei der zuständigen Behörde angemeldet oder von ihr genehmigt werden.

Analog zu ihrem Gefährdungspotenzial werden gentechnische Arbeiten in vier Sicherheitsstufen eingeteilt.

Für diese Bewertung des Risikos und der entsprechenden Sicherheitsmaßnahmen ist die Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit zuständig.

Weiterhin regelt das GenTG auch Haftungs-, Bußgeld- und Strafvorschriften. Nicht erfasst werden gentechnische Arbeiten am Menschen.

Diese sind durch das Embryonenschutzgesetz bzw. Arzneimittelgesetz geregelt.

3.2. Werkzeuge

3.2.1. Restriktionsenzyme

Restriktionsenzyme werden auch Endonukleasen genannt. Dies sind Enzyme, die dazu fähig sind, bestimmte kurze Stücke (bis zu acht Basenpaare) aus der DNA auszuschneiden.

Das Restriktionsenzym der Bakterie E. coli heißt EcoRI.

Generell schneiden Restriktionsenzyme s equenzspezifisch, das heißt sie trennen nur an bestimmten Basenfo lgen, wie zum Beispiel an dieser Basensequenz:

Die beiden Enden werden versetzt abgeschnitten, so dass kurze, kohäsive, überstehende Einzelstrangenden, die sogenannten ,,sticky ends" (,,klebrige Enden") entstehen. Diese Enden werden durch die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen zusammengehalten, trennen sich aber bei Erwärmen. Beim Abkühlen heften sie sich wieder in der ursprünglichen Stellung aneinander.

Vermischt man zwei DNA-Teilstücke, die mit dem gleichen Restriktionsenzym abgeschnitten wurden, lagern sich sie spiegelbildlichen Enden aneinander. Die zugegebenen Ligasen schweißen die Stränge wieder zusammen.

3.2.2. DNA-Vektoren

Ein Vektor ist eine Träger - DNA. Die isolierten Fremdgene werden in den Vektor eingebaut und in den Empfänger (Wirtsorganismus) eingeschleust. Meistens werden als Vektoren Plasmide eingesetzt, aber auch Viren können diese Aufgabe übernehmen.

Bei der Insulinsynthese wird das Plasmid pBR322 verwendet, das aus drei Stücken anderer Plasmide zusammengefügt wurde.

Vektoren müssen zur selbstständigen Vermehrung in der Wirtszelle fähig sein und enthalten mindestens einen Replikaktionsursprung, Schnittstellen für Restriktionsenzyme und Markergene.

Das Fremdgen wird im Vektor entweder in eine Spaltstelle eingebaut (Insertionsvektor) oder ersetzt einen Abschnitt des Vektors mit ähnlicher Länge (Substitutionsvektor).

Nach ihrer Verwendung werden die Vektoren in drei Gruppen eingeteilt:

1. Klonierungsvektoren: dienen der Vermehrung der fremden DNA in der Wirtszelle (also dem Klonieren)
2. Expressionsvektoren: enthalten zusätzlich die erforderlichen Kontrollsignale für die Transkription und die Translation
3. Sequenzierungsvektoren: besitzen eine größere Zahl von Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme.

Sicherheitsvektoren besitzen keine Abschnitte mehr, die eine Übertragung auf andere Zellen ermöglichen würden. Somit wird eine Weitergabe des eingesetzten Gens an andere Organismen unterbunden.

3.2.3. Wirtsorganismen

Wirtsorganismen sind zum Beispiel Bakterien, Pilze, Pflanzen oder Tiere. Im Fall des Insulins dient die Bakterie Escherichia-coli als Wirt, dass heißt als Empfänger und Träger der fremden Erbsubstanz.

In die Wirtsorganismen wird de Vektor eingeschleust.

Die Bakterien die einen Vektor integriert haben, dass heißt Empfänger sind, müssen selektiert(ausgewählt) werden. Dies kann man über Antibiotika - Resistenzen bewirken.

Der Wirtsorganismus vermehrt das fremde Gen zusammen mit dem eigenen Erbmaterial.

4. Beschaffung des Insulins

4.1. Tierisches Insulin

Insulin musste lange Zeit bevorzugt aus Rinderpankreas (Bauspeicheldrüse) isoliert werden, um den enormen Bedarf zu decken.

Aber um nur 100g Insulin auf diese Art zu gewinnen, benötigt man ungefähr 1000kg tierische Bauchspeicheldrüsen. Zudem ist die Aufbereitung der Bauchspeicheldrüsen ziemlich aufwendig und kostspielig da das Gewebe sehr empfindlich ist.

Das wichtigste Argument gegen tierisches Insulin ist die Tatsache, dass weder das Rinderinsulin noch das Schweineinsulin identisch mit dem Humaninsulin ist und deswegen bei der Patientenbehandlung häufig immunbiologische Abwehrreaktionen auftreten.

Beim Rinderinsulin stehen an 8., 9. und 10. Stelle der A-Kette statt der Aminosäuren Theronin, Serin und Isoleucin die Aminosäuren Alanin, Serin und Valin. Außerdem lautet die letzte Aminosäure der B-Kette statt Threonin Alanin. Auch beim Schweineinsulin unterscheidet sich die letzte Aminosäure der B-Kette vom Humaninsulin: hier steht Alanin statt Threonin.

Die biosynthetische Insulinherstellung kann jedoch die Tierschützer nicht trösten:

,,Ohnehin sterben jährlich 50 Millionen Schweine den Schlachthaustod, so dass für die Insulinproduktion aus ihren Bauchspeicheldrüsen wie denen von Rindern kein Mangel herrschen dürfte." (Quelle c) Aber für Menschen, die auf tierisches Insulin allergisch reagieren, ist das Humaninsulin lebenswichtig.

Dieses muss nicht mehr aus Leichenpankreas aufgereinigt werden, sondern kann gentechnisch hergestellt werden.

4.2. Synthese im Genlabor

4.2.1. Escherichia coli (E. coli)

E. coli -Bakterien, auch Kolibakterien genannt, sind ein wichtiger Bestandteil der menschlichen Dickdarmflora. Sie sind Prokaryonten, dass heißt ihnen fehlt eine Kernmembran. Sie gehören der Gruppe der Eubakterien an und sind stäbchenförmig: bei einem Durchmesser von etwa 1*10-3 mm etwa 2-4 *10-3 mm lang.

Ihr Cytoplasma ist relativ homogen und zeigt keinerlei Kompartimentierungen und Organellen (es fehlen, wie bei allen Bakterien, die Mitochondrien, Golgi- Apparate und endoplasmatische Retikula).

Ihre doppelsträngige DNA ist ein einziges, ringförmiges Chromosom, das zwischen 1250*10-3 mm und 1400*10-3 mm lang ist. Es beinhaltet etwa 4*106 Basenpaare. Die Bakterien lassen sich leicht auf Nährmedien, die Mineralsalze, Ammoniumsalze (als Stickstoffquelle) und Zucker (als Kohlenstoffquelle) enthalten, züchten.

Wegen der ausführlichen Kenntnisse über E. coli, seiner einfachen Züchtung und seiner schnellen Replikation (unter optimalen Bedingungen verdoppeln sie sich alle 20 Minuten) werden diese Bakterien häufig für gentechnische Experimente benutzt, so auch für die Insulinsynthese.

4.2.2. Genklonierung bei der Insulinsynthese

Die beiden Gene für die A- und die B- Kette des Insulins werden getrennt produziert. Das jeweilige Gen (zusätzlich mit einem Startcodon für Methionin ausgestattet) wird hinter das lac Z-Gen der E. coli exprimiert. Dieses lac Z-Gen ist das Gen für das Enzym Galactosidase. ,,Dieses Gen steht unter der Kontrolle eines durch Laktose zu aktivierenden Promotors."(Quelle e)

,,Die Ligation [Verbindung durch Ligasen] von Vektor und Strukturgen [Insulingen] führt zu einem Fusionsprodukt mit einem durchgängigen Leseraster vom Startcodon des lac Z-Gens bis zum Stopcodon der Gene von A- bzw. B-Kette." (Quelle d) Durch zusätzlichen Einbau eines Resistenzgens gegen ein Antibiotikum kann später eine gezielte Selektion erfolgen.

Auf den Nährboden wird ein Antibiotika gegeben, so dass nur die Bakterien überleben, die das Resistenzgen (und somit auch das Insulingen) haben. Dazu ist das Verfahren der sogenannten Replika-Plattierung nötig.

Durch Zugabe von CaCl2 wird die Membran des Bakteriums für das rekombinante (neukombinierte) Plasmid permeabel gemacht.

Nach dieser Transformation (Aufnahme der freien DNA) von E. coli können die beiden Ketten des Insulins synthetisiert werden, sobald auch Laktose zugegeben wird um den inaktiven Promotor zu aktivieren.

Wenn die Wirtsorganismen die Ketten in genügender Menge herstellen werden sie nach und nach in immer größeren Fermentern vermehrt, die teilweise bis über 2000 Kubikmeter groß sind. Dort gedeihen sie unter optimalen Bedingungen auf einem speziellen Nährboden.

Um das Insulin zu erhalten werden die Bakterien abgetötet und aufgebrochen. Die Peptidketten der Proteine hinter Methionin werden mit Hilfe von Bromzyan abgespalten und die Ketten werden isoliert.

Die Ausbildung der Disulfidbrücken zwischen den beiden Ketten wird durch Oxidation in einer Lösung erreicht.

5. Literaturverzeichnis

a. Werner Buselmaier (Hrsg.) - ,,Weltbildkolleg Abiturwissen Band Biologie" (5. Auflage 1998; Weltbild Verlag)
b. Jürgen Christner - ,,Genetik kurz gefasst" (2000; Klett Verlag)
c. Ursel Fuchs - ,,Gentechnik - Der Griff nach dem Erbgut. Eine kritische Bestandsaufnahme." (2. Auflage 1996; Gustav Lübbe Verlag)
d. H.G. Gassen/K. Minol (Hrsg.) - ,,Gentechnik. Einführung in die Prinzipien und Methoden" (1996; Gustav Fischer Verlag)
e. Lutz Hafner/Peter Hoff ,,Genetik, Neubearbeitung. Materialien für den Sekundarbereich 11 Biologie" (1995; Schrödel Schulbuchverlag)
f. Barbara Hobom - ,,Pharmaze utische Zeitung - Schriftenreihe:
Gentechnologie. Schlüssel für die angewandte Biologie" (1993; GOVI Verlag)
g. www.medizininfo.de
h. www.wissen.de

Details

Seiten
10
Jahr
2001
Dateigröße
469 KB
Sprache
Deutsch
Katalognummer
v99934
Note
12 Punkte
Schlagworte
Gentechnische Produktion Insulin

Autor

Teilen

Zurück

Titel: Gentechnische Produktion von Insulin